赵永，杨建波，林琳

1新疆医科大学附属中医医院神经外科，乌鲁木齐830000；2新疆医科大学附属中医医院神经内科

蛛网膜下腔出血是指脑表面或脑底部血管破裂后，血液进入蛛网膜下腔而引起的相应临床症状，占所有脑卒中5%～10%[1]。颅内动脉瘤是指脑动脉内腔局限性异常扩大引起动脉壁上的异常膨出，为蛛网膜下腔出血最常见病因，占比约85%，具有起病急、致残率高、病死率高等特点[2]。迟发性脑缺血(DCI)为动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)患者严重神经功能缺损和死亡的重要原因，其发生不仅涉及脑血管痉挛(CVS)，还涉及炎症反应[3]。微小RNA(miRNA)-210为miRNA重要成员，能通过Toll样受体(TLR)/核因子-κB(NF-κB)信号通路调控炎性因子表达[4]。凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)是一种黏附因子，可通过结合氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)增加细胞内活性氧，降低一氧化氮利用率，启动血管扩张抑制[5]。LIN等[6]研究报道，兔aSAH后基底动脉壁上LOX-1和ox-LDL表达上调。因此我们推测LOX-1可能参与aSAH后DCI发生。可溶性凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(sLOX-1)由LOX-1细胞外结构域的蛋白水解性裂解产生，能反映LOX-1表达情况。2016年1月—2020年12月,我们探讨了aSAH后DCI患者血清miR-210、sLOX-1水平变化及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月—2020年12月收治的137例aSAH患者，其中男54例、女83例，年龄32～86(56.07±11.22)岁；体质量指数18～29(24.08±2.19)kg/m2；责任动脉瘤部位：前循环111例，后循环26例；Hunt-Hess分级[7]：Ⅰ级37例，Ⅱ级50例，Ⅲ级30例，Ⅳ级17例。纳入标准：①经CT血管成像确诊，符合文献[7]诊断标准；②初次发病，且为单发颅内责任动脉瘤；③Hunt-Hess分级Ⅰ～Ⅳ级；④发病至入院治疗时间<72 h；⑤年龄≥18岁；⑥临床资料完整者；⑦患者及家属均知情研究；排除标准：①既往aSAH病史或未破裂颅内动脉瘤治疗史者；②血液疾病、颅内感染、肿瘤性卒中继发的aSAH；③脑实质出血破入蛛网膜下腔或外伤性aSAH者；④入院72 h内死亡或放弃治疗者；⑤深度昏迷，无自主呼吸者；⑥入院前合并严重感染者；⑦合并心、肝、肾等脏器功能损害者；⑧妊娠及哺乳期妇女。本研究经伦理委员会批准(2018-12-023)。

1.2 基础资料收集 收集患者基础资料，包括性别、年龄、体质量指数[体质量(kg)/身高(m)2]、吸烟史(≥1支/d，连续吸烟≥6个月)、饮酒史(≥40 g/d，≥1次/周，持续≥6个月)、病史(糖尿病、高血压、冠心病、高血脂症等)、责任动脉瘤部位、动脉瘤直径、Hunt-Hess分级、治疗方式(保守治疗、开颅夹闭、血管内治疗、开颅夹闭+血管内治疗)。

1.3 血清miR-210、sLOX-1水平测定 采集患者入重症监护室时6 mL空腹静脉血，3 000 r/min离心10 min(离心半径15 cm)，取上清，分为两份，置于-80 ℃冰箱中待检。其中一份采用TRIzol法提取血清总RNA(试剂购自北京普利莱基因技术有限公司；货号：R1030)，琼脂糖凝胶电泳检测完整性，Qiagen反转录试剂盒(上海玉博生物科技有限公司；货号：Qiagen 205111)转录合成cDNA，加入miR-210引物(正向引物：5′-CGTAGCTGTAGTCGTAGCTG-3′；反向引物：5′-GATGCTGATCGATCGTGTcG-3′)，以U6做内参(正向引物：5′-ACGTGATGCCGTGACGATCT-3′；反向引物：5′-CGATGTCGAGCTAGTGCTAC-3′)，PCR扩增条件：95 ℃10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，循环40次，反应结束后得到各管Ct，2-ΔΔCt法计算miR-140-3p相对表达量。另一份用酶联免疫吸附法测血清sLOX-1水平，试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司(货号：ARB10414)。

1.4 DCI诊断和分组 DCI定义为出现局灶性神经功能缺损(如偏态、失语、偏盲等)，持续时间>1 h，或格拉斯哥预后量表(GOS)[8]恶化≥2分。且排除代谢紊乱、发烧、癫痫、脑积水、脑水肿、药物效应等其他原因导致的神经功能缺损[9]。根据是否发生DCI分为DCI组(n=33)和非DCI组(n=104)。

2 结果

2.1 两组基础资料比较 DCI组高血压比例、高血脂症比例、收缩压、Hunt-Hess分级高于非DCI组(P均<0.05)。其他指标组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 两组基础资料比较

2.2 两组血清miR-210、sLOX-1水平比较 DCI组、非DCI组血清miR-210水平分别为0.63(0.55,0.68)、0.82(0.69,1.01)，sLOX-1水平分别为1 550.71(1 425.37,1 677.24)、1 123.07(837.57,1 399.36)pg/mL，两组比较，差异均有统计学意义(Z分别为-5.443、-5.879，P均<0.001)。

2.3 aSAH后DCI影响因素的多元Logistic回归分析 以高血压、高血脂症、收缩压、Hunt-Hess分级(≥Ⅲ级=1，<Ⅲ级=0)、miR-210、sLOX-1为自变量，是否发生DCI为因变量(不良=1，良好=0)，多元Logistic回归分析显示，Hunt-Hess分级≥Ⅲ级、高sLOX-1水平为aSAH后DCI独立危险因素，高miR-210水平为独立保护因素(P<0.05)。见表2。

表2 aSAH后DCI影响因素的多元Logistic回归分析

2.4 血清miR-210、sLOX-1水平预测aSAH后DCI的价值 ROC曲线显示，血清miR-210、sLOX-1水平预测aSAH后DCI的AUC、截断值、灵敏度、特异度为0.815(95%CI：0.740～0.876)、0.70、87.88%、71.15%和0.840(95%CI：0.768～0.897)、1362.70 pg/mL、87.88%、74.04%，miR-210+sLOX-1预测aSAH后DCI的AUC为0.910(95%CI：0.849～0.952)，大于miR-210、sLOX-1水平单独预测(Z分别为3.616、2.573，P均<0.05)，灵敏度、特异度为100.00%、76.92%。

3 讨论

aSAH是一种严重威胁人类生命健康的脑血管疾病，DCI为aSAH主要并发症，研究表明，超过30%的aSAH患者在动脉瘤破裂后3～14 d发生DCI，虽然随着诊断模式、医疗条件、显微外科技术的快速发展，aSAH患者预后明显改善，但DCI仍是aSAH致残、致死的重要原因，即使全力抢救，仍有50%的患者因此死亡，其余多数存活患者存留严重神经功能损害，生活不能自理[7]。因此早期预测aSAH后DCI有助于改善aSAH患者医疗资源配置和优化护理，改善预后。颅内动脉瘤破裂后，大量血液进入蛛网膜下腔，红细胞裂解为血红素、血红蛋白等物质于出血部位沉积触发炎症级联反应，进一步损伤血管平滑肌细胞和内皮细胞，诱发CVS，减少脑血流量，导致DCI[3]。

miRNAs是一类由19～24个核苷酸组成的内源性单链非蛋白质编码RNA，主要通过与靶基因mRNA的3′非翻译区的碱基互补结合，使靶基因mRNA翻译抑制和降解，参与调节细胞生长、增殖、迁移、凋亡等多种重要细胞生物进程[10]。miR-210位于人染色体11p15.5，是一种重要缺氧诱导基因，参与抑制细胞增殖、DNA损伤修复和促进血管生成等细胞功能，近年研究发现，miR-210还具有炎症调节作用[11]。肿瘤坏死因子-α是一种涉及系统性炎症的细胞因子，可激活内皮细胞、巨噬细胞释放细胞间黏附分子-1，调节受损区域组织中性粒细胞黏附，启动CVS，也可通过上调Ⅰ型胶原蛋白表达，增加血管壁张力，导致痉挛血管腔持续狭窄[12]。ZACCAGNINI等[13]使用脂多糖诱导巨噬细胞炎症反应发现，miR-210能抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子-α等促炎因子产生，因此我们推测miR-210可能与aSAH后DCI有关。本研究结果显示，DCI组血清miR-210水平低于非DCI组，为aSAH后DCI独立保护因素，说明低表达miR-210与aSAH后DCI发生有关。TLR4是模式识别受体家族成员，在大脑内广泛表达。研究表明，颅内动脉瘤破裂后，神经细胞表面TLR4在红细胞裂解物刺激下能激活NF-κB通路(炎症反应重要信号通路)，增加肿瘤坏死因子-α、细胞间黏附分子-1等促炎因子表达，加剧aSAH大鼠脑血管和神经损伤，单核细胞内TLR4表达与DCI独立相关[14]。ZACCAGNINI等[13]发现，转染miR-210能通过TLR4/NF-κB通路抑制巨噬细胞炎症反应。MA等[14]建立aSAH后CVS大鼠模型发现，枕大池注射miR-20能减少基底动脉壁厚度，增加基底动脉管直径，预防aSAH后CVS发生，蛋白质印迹法检测也发现大鼠基底动脉肿瘤坏死因子-α和TLR4表达显著下调。基于以上研究，我们认为miR-210可能通过TLR4/NF-κB通路抑制炎症反应，发挥aSAH后DCI保护作用。

LOX-1为血管内皮细胞摄取ox-LDL主要受体，参与ox-LDL结合、内吞、蛋白降解等过程，在炎症反应、缺血缺氧、高血糖水平等状态下大量分泌。ox-LDL是动脉硬化发生和发展过程中重要参与者，LOX-1可通过结合ox-LDL，促进泡沫细胞形成，增强泡沫细胞吞噬脂质能力，并能结合其相应配体，加重局部炎性刺激，损伤内皮细胞功能，促进动脉硬化形成[15]。目前大多研究均关注LOX-1与动脉硬化的关系，用以诊断急性缺血性卒中、急性脑出血、缺血性心脏病等[16]。LOX-1参与血管扩张抑制[5]，在aSAH后基底动脉壁大量表达[6]，且与多种缺血性疾病相关，因此我们猜测LOX-1可能与aSAH患者脑血管功能障碍有关。本研究结果显示，DCI组血清sLOX-1水平低于非DCI组，分析是DCI组病情严重，炎症反应刺激内皮细胞大量表达LOX-1有关。进一步分析显示，高血清sLOX-1水平为aSAH后DCI独立危险因素，说明高表达sLOX-1与aSAH后DCI发生有关。目前尚不明确LOX-1参与aSAH后DCI的相关机制，但DCI主要因动脉内皮功能失调和平滑肌收缩引起CVS导致[6]，而LOX-1参与内皮细胞功能损伤。LI等[17]研究发现，抑制LOX-1表达可抑制活性氧/NF-κB信号通路，减轻动脉硬化小鼠炎症反应。近期研究报道，高血清sLOX-1水平与aSAH患者预后不良相关[18]。基于以上研究，我们推测LOX-1可能通过损伤内皮功能和促炎反应参与DCI发生。ROC曲线显示，血清miR-210、sLOX-1水平均对aSAH后DCI有一定预测价值，二者联合AUC增加，说明联合检测能提高aSAH后DCI预测价值。

综上所述，aSAH后DCI患者血清miR-210水平降低，sLOX-1水平升高，为aSAH后DCI发生独立影响因素，联合检测能提高aSAH后DCI预测价值。但aSAH后DCI影响因素较多，本研究并未全部纳入分析，可能存在选择偏倚；同时关于miR-210、sLOX-1与aSAH后DCI的关系尚不明确，缺乏相关机制研究，还需多中心、大样本研究证实。