丁华胜，黄 燕，王凤媛

(1.武汉科技大学附属普仁医院急诊科，湖北 武汉 430081；2.武汉大学心血管病研究所，湖北 武汉 430060)

心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)指心肌组织长时间缺血后给予重新血液灌流后组织损伤反而呈进行性加重的病理过程，其机制主要涉及心肌收缩机能减弱、冠脉流量减少以及血管反应性改变，目前普遍认为细胞焦亡与炎症反应参与了MIRI的病理过程[1-3]。细胞焦亡是以促炎性为特点细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)的新途径，其对半胱天冬酶(Caspase)-1具有依赖性且合并炎症级联反应，同时受到内源性与外源性刺激后产生炎性小体，对下游白介素(Interleukin,IL)-1β 以及IL-18进行诱导并致其活化，生成相关胞内物质，从而介导组织细胞损伤[4-5]。有研究证实，在糖尿病大鼠MIRI模型中，糖尿病大鼠对缺血再灌注敏感性增加，从而加剧MIRI，其机制同NOD样受体家族Pyrin域3(Nod like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)/Caspase-1依赖性细胞焦亡效应有着紧密联系[6]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4) 是一类天然免疫受体，其分布极为广泛，在炎症反应和氧化应激下大量释放，研究表明 TLR4在MIRI中发挥重要作用[7]。

丹皮酚提取自毛茛科植物牡丹的干燥根皮，属于酚类化合物，其味苦且辛，分子量较小，呈白色针状结晶，具有神经保护、抗肿瘤、抗脂质过氧化、消炎、消肿止痛、抗过敏、抗病毒等作用[8-9]。前期研究证实，丹皮酚可通过抑制心肌凋亡保护MIRI大鼠的心肌组织[10-11]。此次实验拟对丹皮酚的心肌保护功能以及对TLR4表达、细胞焦亡的影响进行探讨分析，旨在为丹皮酚的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物： 清洁级雄性SD 大鼠56只，体重220～280 g，均由武汉大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂与仪器：TLR4兔多抗(Abcam公司)；戊巴比妥钠；99%纯度的丹皮酚，各浓度由0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)制备；TTC试剂；NLRP3、Caspase-1、凋亡相关斑点蛋白(Apoptosis related specklein，ASC)以及IL-1β兔多抗；显微镜(OLYMPUS公司)；低温高速离心机(型号Hitachi CF-5，Japan)；千分之一天平(MET-TLER)；动物呼吸机(浙江大学动物仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立、分组与给药：将56只大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、丹皮酚低剂量组(15 mg/kg)及丹皮酚高剂量组(30 mg/kg)，每组14只。丹皮酚低剂量组、丹皮酚高剂量组大鼠均在术前10 d起予丹皮酚溶液腹腔注射，剂量分别为15、30 mg/kg，1次/d。假手术组、缺血再灌注组分别予等剂量的0.9%氯化钠溶液，1次/d。各组大鼠均连续干预10 d。药物干预后，除假手术组外，其余组参照黄鑫等[11]实验研究建立MIRI大鼠模型。MIRI大鼠模型建立步骤：取SD大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，戊巴比妥钠剂量为30 mg/kg，麻醉后予气管插管，连接小动物呼吸机，于胸骨左侧3 mm第4肋间打开胸腔，分离心包后暴露心脏，采用5-0丝线伸至左心耳下缘冠状动脉前降支(Left anterior descending coronary，LAD)发端部位约2 mm处，在结扎线下置入乳胶管后收紧结扎线并打结，阻断0.5 h后剪断结扎线，再灌注4 h。模型建立成功判定标准：结扎线结扎后通过动物心电图标准导联发现ST-T明显抬高，剪断结扎线后，ST-T有所降低。假手术组大鼠仅打开胸腔，不进行血管结扎操作，后缝合术口。

1.2.2 心肌梗死面积的测定：再灌注4 h后对冠脉进行结扎处理，于颈动脉处注入伊文斯蓝1.0 ml，分离心脏，缓冲液冲洗心脏后，去除脂肪、心房、血管等组织，滤纸吸收左心室水分后放置于-20 ℃冰箱冷冻处理。冷冻处理后，取出心脏，心尖朝上，对心室进行切片处理，共切5片，厚度均匀一致，然后进行2,3,5-氯化三苯基四氮唑蓝(Terazolium chloride,TTC)染色法染色，若未见蓝染则为危险区，显示灰白色则为梗死区，根据染色对梗死面积进行计算。

1.2.3 心肌酶测定：再灌注4 h后，采集大鼠动脉血，离心后取血清，采用全自动生化分析仪检测肌酸激酶同工酶(Creatinekinase MB，CK-MB)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活性。

1.2.4 免疫组化法检测TLR4蛋白：各组随机选择5只大鼠采用免疫组化方法检测TLR4蛋白水平，光镜下观察心肌细胞胞浆均质颗粒，若显示棕黄色则判定为阳性细胞。每张免疫组化切片随机在显微图像采集系统辅助下取5个400×视野，通过图像分析软件Image Pro Plus 5.0计算阳性细胞的平均积分光密度(Average integrated optical density，AIOD)，从而得出TLR4蛋白表达水平。

1.2.5 免疫印迹(Western blot)法检测心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表达：大鼠再灌注处理4 h后，采集左心室心肌组织(处于结扎线水平以下)，然后参照分子质量配制12%PAGE胶，电泳后转膜,用5%的脱脂奶粉封闭，4 ℃孵育一抗过夜，用NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-1β对应的HRP标记的二抗孵育，再实施ECL显色处理，以β-actin为内参，计算NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β的相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积比较 根据TTC染色法计算心肌梗死面积，与缺血再灌注组比较，丹皮酚低剂量组、丹皮酚高剂量组大鼠心肌梗死面积均减小，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较(%)

2.2 各组大鼠血清CK-MB、LDH活性比较 见表2。与假手术组比较，缺血再灌注组CK-MB、LDH水平均升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与缺血再灌注组比较，丹皮酚低剂量组、丹皮酚高剂量组CK-MB、LDH活性均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清CK-MB、LDH活性比较(U/ml)

2.3 各组大鼠心肌组织TLR4蛋白表达比较 见表3。与假手术组比较，缺血再灌注组TLR4蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，丹皮酚低剂量组、丹皮酚高剂量组TLR4蛋白表达水平均降低，且丹皮酚高剂量组低于丹皮酚低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠心肌组织TLR4蛋白表达比较

2.4 各组大鼠心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表达比较 见表4(图1)。与假手术组比较，缺血再灌注组心肌组织的NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，丹皮酚低剂量组、丹皮酚高剂量组NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表达均降低，且丹皮酚高剂量组均低于丹皮酚低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表达比较

A:假手术组;B:缺血再灌注组;C:丹皮酚低剂量组;D:丹皮酚高剂量组

3 讨 论

细胞焦亡是近期发现的一类促炎性PCD，其对Caspase-1主要参与的经典炎症小体通路具备依赖性[4]。炎症小体属于多蛋白复合体，其在细胞质中模式识别受体作用下组装而成，可对诸多不同刺激加以识别，再通过诸如NLRC4、NLRP3或NLRP1此类NOD样受体蛋白以及ASC、Caspase-1前体蛋白经由结构域组装，并激活Caspase-1，作用于IL-1β、IL-18等下游因子，促使两者前体裂解与释放，介导细胞渗透性肿胀破裂，产生细胞膜小孔，导致LDH此类胞内成分流出，同时对其它炎症介质、黏附分子的合成与释放进行诱导，导致全身与局部炎症反应放大，引发细胞焦亡[12]。在现今所研究的NOD 样受体中，涉及最多的为NLRP3炎症小体，其主要包括NLRP3、Caspase-1、ASC。对于非微生物危险信号，NLRP3具备炎症识别功能，过表达的ATP、结晶、葡萄糖、胆固醇、活性氧均能够使NLRP3活化，NLRP3可在各类疾病环境中对非微生物危险信号进行有效识别，同时引发非细菌性炎症反应[13]。如细胞表面受体介导的信号通路包括涉及TLR4的通路，在调节焦亡相关的发病机制中发挥重要作用[14-15]。

作为一类信号转导受体蛋白，TLR4同免疫炎症存在紧密联系，其大量分布于巨噬细胞、单核细胞等，并高表达于心肌，目前已明确其信号转导途径，TLR4激活后通过依赖Myd88髓系分化因子和非依赖Myd88传递信号，最终导致核转录因子 (Nuclear factor-κB，NF-κB) 的活化，发生核移位，引起一系列的炎症反应[7,16]。既往研究表明，NLRP3及其下游信号通路引起的焦亡受TLR4介导的机制调节，并进一步加重组织损伤[17-18]。研究证实，在MIRI模型中，microRNA-149通过NLRP3/Caspase-1焦亡通路加重了MIRI[2]。Dai等[19]证实，M2巨噬细胞源性外显子携带microRNA-148a，通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎症信号通路可下调心肌焦亡减轻心肌缺血再灌注损伤。本实验结果显示，与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠心肌梗死面积明显增加，血清CK-MB和LDH的活性升高，TLR4的释放增加，NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表达增加，证明本实验成功制备了大鼠MIRI模型，且TLR4及NLRP3/ASC/Caspase-1焦亡通路促进了MIRI。本实验通过丹皮酚预处理观察对MIRI的影响，发现丹皮酚干预后，TLR4蛋白释放减少，同时NLRP3/ASC及Caspase-1信号途径活化降低，进而下调细胞焦亡，减少了心肌梗死面积，且丹皮酚高剂量组较丹皮酚低剂量组作用更明显。丹皮酚通过抑制TLR4的激活，减少核转录因子NF-κB的活化，抑制NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路介导的细胞焦亡，减轻炎症反应，保护心肌。