蔡丙严，田其真，戴建华，穆晓惠，白佑博

(江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300)

0 引言

禽白血病(Avain leukosis，AL)是由禽白血病病毒(avain leuckosis virus，ALV)和禽肉瘤病病毒引起的禽类多种肿瘤型疾病的统称[1]。禽白血病分布范围广，是一种全球性的传染病，病毒既可以垂直传播也可以水平传播[2]。鸡群一旦感染，会造成内脏器官的肿瘤、免疫抑制、生长与生产性能下降，给养禽业带来巨大经济损失[3]。随着近年来对外源性禽白血病J亚群的深入研究[4]，发现其危害较大，能引起病鸡发生血管瘤和急慢性肿瘤，给养鸡业带来了巨大的经济损失。不同类型、不同品系原种鸡场核心群的外源性禽白血病的净化，是预防禽白血病最基本也是最重要的一环[5]。中小规模自繁自养的鸡群，尤其是一些地方品种的鸡群，对禽白血病的净化工作不到位，致使鸡群的感染率在30%以上[6]。因此，有必要对一些有价值的地方品种鸡群尽快启动AL净化程序[7]。目前，种鸡场开展的AL净化方法主要是检测、淘汰与做好生物安全措施。临床实践中，常采用p27抗原免疫胶体金试纸条、ELISA试剂盒及PCR等检测技术进行检测。芦花鸡、苏禽绿壳鸡和新杨黑鸡为我国土生或自主培育的蛋肉兼用品种。为了解这3个地方品种鸡中ALV的自然感染状态，项目组分两批次采集泄殖腔棉拭子与血清样品，采用免疫胶体金试纸和ELISA 2种方法进行ALV的检测，并通过PCR方法检测了鸡群中ALV-J亚群感染情况，同时，对检测出的阳性鸡只及时进行淘汰。研究结果为我国地方品种鸡ALV的防控提供了重要的监测数据，为进一步做好ALV的净化工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂及引物设计

ALV p27抗原检测试纸条(扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室研发产品)；DNA Marker、dNTP等试剂(购自上海生工生物工程技术有限公司)；DNA提取试剂盒(购自AXYGEN公司)；禽白血病病毒抗原检测试剂盒(购自爱德士(IDEXX)生物科技有限公司)。参考文献[8]设计鉴定ALV-J的RT-PCR引物H5/H7序列为：H5 5′-GGATGAGGTGACTAAGAAAC-3′/H7 5′-CGACCAAAGGTAACACACG-3′，PCR反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 10 min；扩增ALV-J的pol至gp85基因片段，预计大小545bp。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2 检测方法

对芦花、苏禽绿壳、新杨黑3个地方品种鸡，于15周龄、25周龄分2批次采集泄殖腔棉拭子于装有含双抗PBS的指形管中，采集后24 h内送回实验室冻融，检测前将样品液氮中反复冻融2次，恢复至室温，沉淀杂质，按p27抗原试纸条说明书进行检测；无菌翅静脉采血2 mL，分离血清，按ELISA试剂盒说明书进行检测；无菌采集阳性鸡的抗凝血样品2 mL，4℃冰箱保存不超过12 h，按照试剂盒说明提取基因组，扩增ALV-J的pol至gp85基因片段。

1.3 鸡群净化

根据每次检测结果，淘汰p27抗原阳性鸡只；严格执行生物安全措施，鸡舍及其周围用 1：500的比例稀释的二氯异氰尿酸钠消毒不少于2次/d[9]；鸡舍饲养管理实行定员责任制，及时清理鸡粪并做无害化处理。

2 结果与分析

2.1 p27抗原试纸条检测结果

在15周龄，分别采集芦花、苏禽绿壳、新杨黑鸡3个地方品种鸡泄殖腔棉拭子样品各700份，总计2 100份。检测结果显示，阳性数共计644份，总阳性率为30.67%，其中芦花、苏禽绿壳、新杨黑3个地方品种鸡的阳性率分别为32.42%、24.57%、35.00%。在25周龄，分别采集芦花、苏禽绿壳、新杨黑鸡3个地方品种鸡泄殖腔棉拭子样品各500份，总计1 500份。检测结果显示，阳性数共计159份，总阳性率为11.20%，其中芦花、苏禽绿壳、新杨黑3个地方品种鸡的阳性率分别为11.80%、7.20%、14.60%，具体如表1所示。

表1 三个地方品种鸡15、25周龄ALV p27抗原试纸条检测阳性率

2.2 p27抗原ELISA检测结果

在15周龄和25周龄分2批次对芦花、苏禽绿壳、新杨黑3个地方品种鸡共采集600份血清样品进行检测。检测结果显示：15周龄时，阳性数共计113份，总阳性率为31.38%，其中芦花、苏禽绿壳、新杨黑3个地方品种鸡的阳性率分别为34.16%、24.16%、35.83%；25周龄时，阳性数共计30份，总阳性率为12.50%，其中芦花、苏禽绿壳、新杨黑3个地方品种鸡的阳性率分别为12.50%、8.75%、15.00%，具体如表2所示。

表2 三个地方品种鸡15、25周龄ALV p27抗原ELISA检测阳性率

2.3 ALV-J亚群抗原PCR检测结果

无菌采集阳性鸡的抗凝血样品2 mL，4℃冰箱保存不超过12 h，按照试剂盒说明提取基因组，扩增ALV-J的pol至gp85基因片段。大小约545 bp，如图1所示。

图1 ALV-J的pol至gp85基因PCR扩增片段

2.4 鸡群净化结果

综合ALV p27抗原试纸条和p27抗原ELISA检测结果，鸡场对15周龄检测出阳性的鸡只进行了淘汰，并采取了加强饲养管理、消毒及无害化处理等净化控制措施，至25周龄检测时，鸡群ALV阳性率显著下降，ALV p27抗原试纸条检测总阳性率由15周龄的30.67%下降至11.80%，共下降了19.47%，ALV p27抗原ELISA检测总阳性率由15周龄的31.38%下降至12.50%，共下降了18.88%，2种检测方法阳性率较为一致，由此看出经过两次的检测淘汰，鸡场AL的净化成效非常显著，结果如表1、表2所示。

3 讨论

国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020 年)中明确提出，禽白血病是国家优先防治的传染病。深入研究禽白血病，有效防控和消灭禽白血病，对促进我国养禽业的健康发展具有重要的意义[10]。AL在我国养禽业中是一种普遍现象，ALV在鸡群特别是我国地方品种的鸡群中广泛存在。崔治中[6]等对广东某“三黄鸡”种鸡场禽白血病的检测显示，3 个地方品种的祖代鸡均感染了禽白血病病毒，且感染比例平均达33%。姬向波[11]等对河南省5个地方品种鸡禽白血病病毒检测显示，河南地方品种鸡群总体ALV p27抗原阳性率为泄殖腔拭子22.62%、血清26.83%、蛋清12.90%；5个品种鸡群的血清ALV p27阳性率依次为河南斗鸡84.48%、淅川乌骨鸡53.78%、固始鸡19.81%、三黄鸡17.22%、卢氏鸡16.67%，但同品种不同场区间差异较大。本研究结果显示，芦花、苏禽绿壳、新杨黑鸡3个地方品种鸡15周龄首次检测时泄殖腔样品p27抗原试纸检测阳性率分别32.42%、24.57%、35.00%；血清样品ELISA检测阳性率分别为34.16%、24.16%、35.83%，研究结果与崔治中等对“三黄鸡”的检测比较接近，与姬向波等对河南5个地方品种鸡的结果差异较大，可能与不同品种鸡、不同检测周龄等有关。

ALV p27抗原快速检测试纸条具有操作简便、快速出结果、敏感性高等优点，尤其是适合种鸡场快速、大规模禽白血病的检测与净化工作。但实践操作中，影响检测结果的主要因素有泄殖腔拭子稀释液缓冲液的量、反复冻融次数、试纸条反应的时间等，因此，应想办法创造好的检测条件，以免影响检测结果的准确性。ALV p27抗原ELISA试剂盒具有检测快速、敏感性高、操作简便、易于标准化等优点，但由于其检测样品多为血清，对样品采集、实验操作、设备等都有较高的要求，适合用于种鸡场核心鸡群的复检工作。本研究同时运用2种ALV检测方法，分2个时期对芦花、苏禽绿壳、新杨黑3个地方品种鸡的泄殖腔拭子和血清样品进行了检测，结果显示，2种检测方法符合率达到98.70%。因此，建议种鸡场首次对鸡群大面积调查ALV感染情况时采用p27抗原快速检测试纸条，对于核心种鸡群进行ALV复检时运用ALV p27抗原ELISA试剂盒检测，以减少相关工作量。

ALV-J亚群白血病病毒是20世纪80年代末分离并鉴定出的鸡白血病病毒的一个新的亚群[12]。该群病毒主要引起肉用型鸡的骨髓样细胞瘤，而蛋用型鸡自然感染时很少引起肿瘤。当前我国鸡群 ALV-J的问题集中在各地自繁自养的培育型黄羽肉鸡及我国地方品种鸡中。唐中文[13]对安徽省16例疑似感染禽白血病的地方品种鸡，通过 PCR扩增方法对患病鸡检测、ALV-Jgp85基因扩增、测序、分析比较，结果检出10份J亚群禽白血病病毒。王培坤等[14]对疑似患有禽白血病的广西麻鸡进行病理剖检、接种DF-1细胞进行病毒分离以及对细胞培养上清进行p27抗原检测、细胞培养物进行PCR扩增，并对分离到病毒的gp85基因进行测序和分析比较。结果表明，从该病鸡同时分离到了A亚群禽白血病病毒(ALV-A)与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)。本研究采集部分p27抗原检测阳性鸡的抗凝血40份，提取基因组，扩增ALV-J的pol至gp85基因片段进行PCR检测，结果有32份样品扩增出545 bp目的片段，表明这芦花、苏禽绿壳和新杨黑这3个地方品种鸡主要感染的禽白血病病毒类型为ALV-J亚群禽白血病病毒。本研究结果与唐中文、王培坤对地方品种鸡ALV-J亚群禽白血病的检测一致，更进一步论证了ALV-J亚群禽白血病病毒为当前地方品种鸡禽白血病的主要感染类型。

4 结语

目前，尚无有效的疫苗预防禽白血病，因此，采取严格的生物安全措施，进行病原检测、淘汰外源性ALV所感染的鸡只、净化种群等方法控制该病是一项紧迫的任务。对于自繁自养的地方品种原种鸡场核心群白血病的净化，对预防和控制禽白血病显得至关重要，做到从源头消灭传染源。本研究结果显示，经过15周龄、25周龄2个禽白血病病毒排毒高峰期的检测、淘汰阳性鸡、严格执行生物安全等措施，芦花、苏禽绿壳、新杨黑3个地方品种鸡ALV总阳性率下降了18.88%～19.47%，鸡场AL的净化成效非常显著。总结本研究成效显著的原因主要为：这3个地方品种鸡感染的主要是外源性ALV-J亚群禽白血病；本研究采用ALV p27抗原检测试纸条与ALV p27抗原ELISA检测试剂盒2种检测方法的同时运用，可检测出所有亚群禽白血病病毒共有的p27抗原[9]，将内源性和外源性禽白血病同时检测剔除；同时执行严格的淘汰和生物安全措施降低了禽白血病的外源性感染。研究结果为地方品种鸡禽白血病的检测、净化提供了依据与参考。