程琳琳，安 锋*，谢贵水，王纪坤，王立丰，张希财

(1.中国热带农业科学院 橡胶研究所，海南 海口 571101；2.农业农村部儋州热带作物科学观测实验站，海南 儋州 571737)

天然橡胶是重要的工业原料和战略物资，2019年我国橡胶树种植面积约达114.7万hm2，仅次于印度尼西亚和泰国(两国橡胶种植面积均为367.6万hm2)[1]。异于橡胶树原产地的热带季风气候环境，我国植胶区地处热带北缘和南亚热带，寒害是其主要的限制因子[2]。寒害常使橡胶树产量降低，也直接威胁树体的生存，进而影响了栽培橡胶树的经济效益。根据寒害发生时的天气条件[3]，寒害对树干危害较严重的症状表现为爆皮流胶，导致树皮受损甚至树体死亡。树干是橡胶树产胶和割胶的主要部位，树干的受害将直接影响橡胶树的胶乳生产，从而严重影响胶园的整体产量。在寒害调查和评价中，树干流胶程度是橡胶树寒害分级的关键标准[4]。因此，如何减少因寒害而产生的爆皮流胶症状对橡胶树的抗寒栽培管理至关重要。

脱落酸(ABA)作为重要的信号分子物质，是植物抵御非生物胁迫的一种天然激素，在植物的旱、盐、低温等逆境反应中发挥重要的作用[5-7]，也是植物水分平衡和胁迫适应性的重要调节因子，在植物的抗寒驯化中起着重要的作用[8]。王纪坤等[9]采用7-33-97芽接苗为材料，喷施脱落酸溶液后进行低温处理，发现ABA可以提高橡胶树细胞渗透调节物质的含量，提高其体内的各种保护酶活性，降低膜脂过氧化程度，从而提高其抵御低温胁迫的能力，以25 mg/L的ABA预处理的抗寒效果最佳。壳聚糖是一种大的阳离子多糖，它是我国资源丰富且相对廉价的化合物，具有良好的成膜性、附着性和吸湿性[10]。壳聚糖能促进植物的生长与抗渗透物质的合成，增强清除氧自由基的能力，防止膜系统受破坏，从而增强植物自身抵抗能力[11]。壳聚糖在提高水稻幼苗[12]、茶树[13]、草莓[14]、荔枝[15]等作物的抗寒性及种子萌发[16-18]等方面具有良好的效果，可以作为激发子启动植物防御系统，提高植物的抗冷性。在橡胶树上，王立丰等[19]认为0.05 g/L壳聚糖提高橡胶树芽接苗和萌条抗寒性的效果最佳。Ca2+作为第二信使参与了植物的营养生长、代谢调节过程。同时，作为磷脂的磷酸根和蛋白构象灵活变化的信号，它还可以防止亚细胞结构被破坏，稳固膜的结构，从而使得植物适应环境的胁迫[20]。外源CaCl2的使用改变了细胞内Ca2+浓度，Ca2+作为第二信使传递细胞外的信息到细胞内，调节植物生理变化，从而提高植物对寒冷环境的适应性，在胡椒[21]、番木瓜[22]、闽楠[23]等植物中均有报道。张希财等[24]在橡胶树袋装苗防寒中用到了CaCl2，认为0.05～0.30 g/L CaCl2对橡胶树袋装苗防寒具有良好的效果。

目前，市售割面涂封剂大多数为成膜剂、单一生长调节剂与各种植物油脂混配，主要是通过生长调节剂促进树体生长，以及油脂膜使割面与外界隔离而起到物理防护作用，在树皮防寒方面，主要是对外界低温的被动防御，另一方面，一旦防护膜受外界大风、雨水等因素脱落，其防寒效果就会失去。复配割面涂封剂克服大多数市售割面涂封剂的被动防御机制，结合脱落酸、壳聚糖、CaCl2在橡胶树抗寒调节中的作用，诱导树体自身的抗寒性，提高树体自身抵御低温的能力。据此，本试验以热研7-33-97橡胶树袋装大型苗为材料，结合前人在橡胶树防寒、抗逆方面研究效果与试验筛选的基础上，分析了以脱落酸、壳聚糖和氯化钙混配的割面涂封剂对低温胁迫下橡胶树的生理影响，为复配割面涂封剂的研发和橡胶树抗寒栽培提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为热研7-33-97橡胶树大型全苗(2018年8月芽接，高度为2.1～3.5 m，2019年8月从苗圃移植至育苗容器)。选择生长正常、生长势基本一致的植株作为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 以市面上销售的橡胶树割面涂封剂为T1，以ABA 25 mg/L+壳聚糖0.05 g/L+CaCl28.0 g/L混合液与毛棕榈油(由本单位油棕种质资源课题组研发)混配后作为T2(即新型复配割面涂封剂)，以清水作为对照(CK)。将试剂1(T1)、试剂2(T2)、清水分别涂抹在橡胶树植株已木质化的茎干部位，每个处理20株。自然条件下，2种试剂用清水涂抹2 d后，将所有植株移入人工气候室中，进行低温胁迫处理。人工气候室控制条件：12 h光照，12 h黑暗，相对湿度为80%；光照时段的光照强度为75～100 lx，温度控制在(16±1)℃；黑暗时段的温度控制在(4±1)℃。分别于低温胁迫的第2、5、8天选取植株木质化茎干的韧皮部，测定其各项生理指标；从植株开始出现流胶症状时，记录已木质化茎干和其他部位流胶情况，低温胁迫的第9天统计最终的流胶情况。

1.2.2 测定方法 每个时间梯度生理指标测定均选取3个植株木质化茎干韧皮部混合后设置3个重复。茎干韧皮部相对含水量和相对电导率测定参照李小琴等[25]的方法。可溶性糖(SS)和超氧阴离子(O2-·)含量采用北京索莱宝科技有限公司的试剂盒测定。可溶性蛋白(SP)含量采用考马斯亮蓝G-250法[26]测定。游离脯氨酸(Pro)[26]含量采用酸性茚三酮法测定。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[27]测定。SOD活性采用NBT光化还原法[26]测定。POD活性采用愈创木酚法[27]测定。CAT活性采用紫外吸收法[28]测定。橡胶树流胶情况根据流胶处的形状进行统计：采用游标卡尺测量流胶的长度、宽度等，然后计算各个处理的已木质化茎干和其他部位的点状和条形流胶的总面积。

1.3 数据处理

所有试验数据为3次重复测定的平均值，采用Excel 2007软件对进行数据处理与分析，并采用Origin Pro 2018软件进行绘图，多重比较采用Duncan新复极差法。

2 结果与分析

2.1 不同处理对低温胁迫下橡胶树茎干韧皮部相对含水量和相对电导率的影响

低温下，植株的吸水量减少，在低温胁迫的开始，植株主要通过降低含水量来达到抵御低温的目的。如图1所示，在低温胁迫2～5 d的过程中，植株相对含水量(RWC)呈下降的趋势。后期，由于植物对低温胁迫的适应性，5～8 d过程中，植株的RWC又有所升高。由于复配割面涂封剂可以有效提高细胞液浓度，维持细胞的渗透压，减缓低温胁迫下橡胶树茎干韧皮部RWC的降低，所以，T2的植株RWC与T1和CK相比，效果达到了显著(P<0.05)或者极显著水平(P<0.01)，低温处理2、5、8 d，T2分别比T1和CK提高了4.24%、4.35%、1.88%和5.98%、6.44%、4.51%。

图1 不同处理对橡胶树茎干韧皮部相对含水量和相对电导率的影响

植物组织相对电导率的大小反映了其细胞电解质渗出相对含量的高低。不同处理在低温胁迫2～8 d过程中，低温胁迫的开始，植株对低温具有一定的适应性，但是随着低温时间的延长，植株细胞膜出现了一定的损伤，所以细胞液部分外漏，与植株茎干韧皮部RWC的变化趋势一致，植株茎干韧皮部REC呈先下降后升高的变化趋势。由于T2的效果较优，有效缓解了细胞电解质的渗出量，从而减缓了橡胶树茎干韧皮部REC的升高，与T1和CK相比，低温处理2、5、8 d时，分别降低35.32%、21.38%、21.44%和40.00%、35.40%、22.13%，差异均达到了极显著水平(P<0.01)。

数值为3个数值的平均值，误差棒为标准差，小写字母表示处理间存在显著差异(P<0.05)，大写字母表示处理间存在极显著差异(P<0.01)。下同。

2.2 不同处理对低温胁迫下橡胶树茎干韧皮部渗透调节物质含量的影响

低温下，植物细胞产生Pro、SP、SS等一系列渗透调节物质，其中游离脯氨酸可以稳定植物组织代谢和细胞原生质体的胶体状态，降低植物的冰点；可溶性蛋白可以提高细胞保水能力；可溶性糖可以维持植物细胞膨压。低温处理2～5 d，植株细胞外渗减少，组织中Pro外渗减少，所以，Pro先呈现下降的趋势，随着低温胁迫时间的延长，细胞有了一定的损伤，组织外渗有所增加，所以Pro含量又有所增加。

由图2可知，经不同试剂处理后，植株茎干韧皮部游离Pro含量呈先下降后上升的趋势。低温2～5 d过程中，由于植株自身的保护作用，细胞含水量降低，组织中SP和SS含量增加，随着5～8 d低温环境的延续，SP结构被破坏，SS发生降解，因而植株茎干韧皮部中SP和SS含量又呈现了下降趋势。由于T2可以有效提高橡胶树茎干韧皮部游离Pro、SP、SS等渗透调节物质的含量，有效地避免了低温对植株的损伤，与T1和CK相比，Pro、SP、SS含量差异均达到了显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)。

图2 不同处理对低温胁迫下橡胶树茎干韧皮部渗透调节物质的影响

2.3 不同处理对低温胁迫下橡胶树茎干韧皮部产生活性氧的影响

低温胁迫造成植物体内氧代谢的加速，植物就会产生大量包含O2-·在内的活性氧物质，MDA是植物细胞膜脂过氧化的产物，它的含量体现了细胞膜受损的程度，低温胁迫下，由于植株膜系统受低温胁迫的影响，橡胶树植株组织中O2-·和MDA的含量逐渐上升。后期，由于植株组织渗透调节物质的产生，对植株细胞膜系统产生了一定的保护作用，MDA和O2-·的含量又逐渐降低。但是，与T1和T2不同的是：CK可能是渗透物质含量较低的原因，导致O2-·含量一直呈现上升的趋势。

由图3可知，不同试剂处理后，在低温胁迫2、5、8 d时，T2植株茎干韧皮部中的MDA含量，T2分别比T1和CK降低40.26%、34.95%、34.00%和48.46%、49.31%、53.48%，差异均达到极显著水平(P<0.01)。植株茎干韧皮部的O2-·含量，T2分别比T1和CK降低45.87%、23.14%、32.03%和56.64%、31.29%、43.93%，差异均达到极显著水平(P<0.01)。以上结果表明，T2在降低低温胁迫下，橡胶树茎干韧皮部的MDA和O2-·含量方面，效果优于T1和CK。

图3 不同处理对橡胶树茎干韧皮部丙二醛和超氧阴离子含量的影响

2.4 不同处理对低温胁迫下橡胶树茎干韧皮部活性氧清除相关酶类的影响

逆境下，为了避免植物产生的活性氧(ROS)对生物系统的氧化伤害，植物细胞会产生一系列酶类抗氧化剂来克服活性氧的毒性。SOD可以有效清除植物细胞内O2-·的含量，从图4可知，SOD活性随着低温胁迫的延长而呈现下降的趋势，与图3中的O2-·含量变化并不一致，可能是SOD清除了大量超氧阴离子而致使SOD的活性有所下降的缘故，T2分别比T1和CK高出16.81%、1.85%、10.70%和97.37%、19.04%、13.77%，差异达到显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)。POD可以有效降低因低温胁迫而产生的氧自由基，POD活性的变化趋势与MDA含量的变化趋势一致，这证明了POD在降低氧自由基对细胞膜过氧化中的作用，T2的橡胶树茎干韧皮部POD分别比T1和CK高41.58%、41.79%、38.07%和1.23倍、1.29倍、1.20倍。CAT可以有效分解H2O2。CAT活性的变化趋势与POD活性的变化趋势一致：先上升后下降，T2分别比T1和CK高出1.83倍、47.93%、63.56%和3.48倍、2.07倍、2.34倍，差异达到显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)。以上结果表明，与T1、CK相比，在提高低温胁迫下橡胶树茎干韧皮部活性氧清除系统中SOD、POD和CAT等相关酶活性方面，T2的效果更佳。

图4 不同处理对低温胁迫下橡胶树茎干韧皮部SOD、POD、CAT活性的影响

2.5 不同处理对低温胁迫下橡胶树流胶的影响

低温胁迫的第4天，植株开始出现流胶症状，低温胁迫的第8天，植株流胶症状达到顶峰。流胶多出现在植株茎干的叶痕处、未木质化的复叶叶柄处及幼嫩茎干处。对于已木质化茎干，T2流胶个数比T1和CK均减少83.33%，T2流胶面积比T1和CK分别减少90.97%和98.81%；对于其他部位，T2流胶个数比T1和CK分别减少20.00%和65.22%，T2流胶面积比T1和CK分别减少91.37%和53.37%(表1)。由此可知，低温胁迫下，T2既有效降低了橡胶树涂抹复合涂封剂的流胶症状，也促进了未涂抹部位抵御寒害的能力，降低了未涂抹部位流胶症状的发生。

表1 低温胁迫下调节剂使用对橡胶树流胶的影响

3 结论与讨论

寒害作为中国天然橡胶树种植区主要的气象灾害之一，也是中国植胶区特有的主要限制性因子[29]。由于气候的变化，橡胶树寒害发生总体呈逐年减少的趋势。但是，不断增加的极端天气事件致使严重或特重的橡胶树寒害呈上升的趋势，天然橡胶的产量面临巨大的挑战[30]，主要体现在以下2个方面：一是全球变暖造成的树体物候期提前所遭遇的突如其来的寒害，二是全球变暖引起的植胶区北移而增加的遭受寒害的风险[3]。橡胶树寒害树冠受寒症状为嫩叶枯焦，叶片、枝条干枯，茎干受害表现为黑斑，外层或整个树皮受害，严重出现爆皮流胶和由于茎基流胶的“烂脚”症状[31]。橡胶树爆皮流胶可能发生在树体的所有部位，但是由于橡胶树生产的特殊性，树干爆皮流胶危害最严重。因此，如何采取相应的栽培技术措施以减少流胶症状的发生和探索橡胶树耐受低温胁迫的机理，对橡胶树的抗寒栽培至关重要。生产中常用割面涂封剂在橡胶树停割后对割面进行涂封，以达到橡胶树对寒害的预防，但是，大多数市售的割面涂封剂仅由成膜剂、单一生长调节剂与各种植物油脂混配而成，主要是通过生长调节剂促进树体生长及油脂膜使割面与外界隔离起到物理防护作用，只能使树体进行被动地防御寒害。在本研究中，复配割面涂封剂可以诱导树体自身抵御低温胁迫的各种机制，有效促进橡胶树的冷驯化，并降低了低温胁迫下橡胶树植株流胶症状的发生，对于实际生产具有重要的应用依据。

橡胶树抗寒生理研究的早期，组织含水量、细胞透性、代谢过程中清除自由基的酶类、起渗透调节作用的有机物质等生理指标就已作为评价橡胶树抗寒能力的基本参数[2]。低温胁迫发生时，生物膜的膜相从液晶相转变为凝胶相，细胞外部渗透压膨胀，膜上产生更多的诸如超氧阴离子、过氧化氢等的氧自由基，加快了膜脂过氧化产物MDA的积累，致使膜发生破裂，膜透性增加，膜内携带水的可溶性渗透物质渗出，植物含水量降低，植物组织相对电导率上升[32]。由于ABA是植物水分平衡和胁迫适应的重要调节因子，明显增强植物抗氧化防御系统，增加植物渗透调节物质含量，激发植物对低温等逆境的适应性响应，引发植物冷驯化，提高植物抗寒性[33-34]。Rouhollah等[35]在外源ABA对“Sultana”葡萄低温胁迫下影响的研究中，发现ABA可以提高低温胁迫下“Sultana”葡萄叶片相对含水量、可溶性糖、脯氨酸和总酚化合物的增加，降低相对电导率。鲁荣海等[36]在脱落酸处理对低温胁迫下茄子幼苗生理生化影响的研究中，发现喷施不同浓度的ABA处理均能提高低温胁迫下茄子幼苗SOD、POD、CAT的活性，增加其SS、SP的含量，降低其REC和MDA含量，促进茄子幼苗在低温下的生长，缓解低温对茄子幼苗的伤害，并提高茄子幼苗对低温胁迫的抵御能力。壳聚糖是甲壳素经强碱脱乙酰的产物，也叫甲壳胺，在农业生产中应用较为广泛，可以有效提高作物抗逆性[37]。壳聚糖(chitosan)可以降低低温胁迫玉米幼苗的MDA含量和REC，提高SS和Pro含量，提高过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性，从而提高其抵御低温的能力[38]。王沛等[39]在喷施壳聚糖对核桃抗冻性影响的研究中，发现外源壳聚糖可以显著提高核桃枝条内SOD、CAT、POD活性及Pro含量，提高核桃树的抗寒性。刘术均等[40]发现叶面喷施壳聚糖溶液可以有效地提高低温胁迫下茄子幼苗的Pro、SS含量，提高SOD、CAT、POD的活性，延缓细胞质膜过氧化的进程，维持细胞膜的完整性，最终降低其低温冷害指数，提高茄子幼苗抵御低温的能力。Ca2+是植物在非胁迫和胁迫条件下生长发育必需的基本元素，它具有构造元素(细胞壁、细胞膜的结构成分)和第二信使的双重作用。黄玉婷等[41]为了解钙离子信号通路与茶树抗寒性之间的关系，采用人工模拟低温和外源施用钙调素(CaM)抑制剂、钙信号通道抑制剂和CaCl2，测定茶树叶片抗寒相关生理指标，结果表明：钙调素抑制剂和钙信号通道抑制剂使低温胁迫下茶树SOD活性降低；外源Ca2+则提高了其SOD活性。廉洁等[42]在CaCl2对低温胁迫下番茄幼苗的影响中发现，外源CaCl2维持了低温胁迫下植株内部SOD、POD活性稳定，清除植株体内过量氧化物，对抗冷胁迫对植株造成的损害，从而提高耐冷型番茄品种应对冷胁迫的能力。但这些研究均局限于单一物质对植物抗寒生理的影响。在本研究中，复合割面涂封剂由ABA、壳聚糖、CaCl2复配而成，处理橡胶树植株后，维持了低温胁迫下韧皮部细胞RWC，减缓了电解质渗出率REC的升高，降低了活性氧物质O2-·含量和膜脂过氧化物的MDA含量，增加了渗透调节物质Pro、SP、SS的含量，增强了抗氧化系统中SOD、POD、CAT的活性，保护了脂膜系统，降低了低温对植株的伤害，提高了植株抵御寒冷的能力，从而降低了植株流胶症状的发生率，因此，新型割面涂封剂有效提高了植株的抗寒性。

有机物(激素或非激素)与无机物复配的抗寒调节物质是利用它们相互间的协同诱导效应，激发植物一系列生理生化反应，从而提高植物抗寒性。复配剂的效果优于单一抗寒调节物质，在棉花[43]、玉米[44]、油菜[45]等作物上均有报道。本研究中所用的抗寒调节物质是基于ABA[9]与壳聚糖[19]在提高橡胶树抗寒性的基础上，与无机物CaCl2混配，结合ABA在植物冷驯化、壳聚糖在作物抗寒及CaCl2在植物逆境胁迫中的有效调节作用，有效增强了橡胶树植株质膜的相对稳定性，维持了组织的水分平衡，促进了其抗氧化防御系统的作用，最终提高了低温胁迫下橡胶苗的抗寒性，有效降低了植株因低温造成流胶症状的发生率，对橡胶树新型割面涂封剂的研发、抗寒栽培措施的实施及抗寒机理探索提供了重要的理论依据。