李建华 侯 静 黄登亮 田美媛 张耀刚 刘 哲 马艳艳

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种引起肝脏脂肪沉积的疾病，发生于男性饮酒量<30g/d，女性饮酒量<20g/d的人群[1]。根据病理诊断，NAFLD可分为单纯性脂肪变性和脂肪性肝炎。进展型非酒精性脂肪肝，即非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，可导致肝硬化和肝细胞癌[2]。随着社会经济水平的提高，不良生活方式和饮食习惯使得NASH的发生率显著提高。NASH影响世界25%人口，已经成为世界重大公共卫生问题，预计在2016～2030年期间，与NASH相关的病死率将增长1倍[3, 4]。研究发现，部分NASH患者发展成肝硬化,其风险远高于单纯性脂肪肝[5]。

目前，甘油三酯(triglyceride, TG)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)是临床上评价肝功能的常用指标，NASH引起TG、AST、ALT升高，同时研究也发现血浆高浓度TG可以引起脂肪变性[6，7]。饱和脂肪酸到单不饱和脂肪酸比率影响细胞的生长和分化，这一比率的改变可造成肝功能紊乱、小肠炎症等疾病[8]。油酸属于单不饱和脂肪酸，是人类饮食中最丰富的脂质形式之一，与其他脂肪酸比较，其在循环中的含量相对较高，常被用来建造非酒精性脂肪肝模型[9～12]。目前NASH的研究主要集中肝细胞的氧化应激反应及凋亡，很少有研究报道在NASH肝细胞中油酸代谢产生的活性氧(ROS)是如何影响细胞周期及凋亡。

细胞模型常被用于研究脂肪变性，研究常采用HepG2及L02细胞系， AML-12是正常小鼠肝脏细胞，本研究通过油酸处理AML-12细胞建立NASH细胞模型，观察细胞脂肪变性，分析ROS、周期及细胞损伤变化，为NASH的发病机制及预防提供理论基础[10～12]。

材料与方法

1.材料：小鼠AML-12细胞株购自上海通派生物科技有限公司。油酸(货号：01008)、油红O(货号：00625)、DMSO(货号：34943)购自美国Sigma公司；DMEM(货号：2230805)购自美国Gibco公司；ROS检测试剂盒(货号：S0033M)购自上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-PI凋亡试剂盒(货号：556547)购自美国BD公司；TG(货号：A110-1-1)、AST(货号：C010-2-1)、ALT(货号：C009-2-1)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；EdU细胞增殖检测试剂盒(货号：RN:R11053.9)购自广州瑞博生物科技有限公司。

2.细胞培养及处理：小鼠肝细胞系AML-12用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱培养。……