黄甫静，张金娟，董莉，冯敏，廖尚高，何迅

(1.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550025；3.葵花药业集团贵州宏奇有限公司，贵州 六盘水 553400；4.贵州医科大学 医药卫生管理学院，贵州 贵阳 550025)

脾虚证泛指因脾气虚损引起的一系列脾脏生理功能失常的病理现象及病症。饮食不节、劳逸失度、久病体虚等都会使脾气受损而引起脾虚证的发生，继而出现神疲、乏力、厌食、便溏和腹痛等症状。现代研究表明，“脾失健运”主要表现为胃肠消化、吸收功能的减弱和胃肠内分泌的失调[1-3]，以及免疫功能降低等方面的改变[4-6]，是多器官、多系统出现功能减退的综合性证候[7]，胃肠功能紊乱是其病理改变的主要特征。芪斛楂颗粒系由黄芪、山药、炙甘草等11味药味组成的中药制剂，在用于治疗小儿脾胃气虚、脾失健运证引起的厌食、偏食、汗多、大便不调、易感冒等症状时疗效显著，但其改善脾虚引起的胃肠功能紊乱和免疫力低下的作用尚不明确。本研究采用饮食不节、过度劳累和苦寒破气相结合的复合因素法建立脾虚大鼠模型，观察芪斛楂颗粒对脾虚模型大鼠胃肠功能及免疫系统的影响，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药物与试剂 番泻叶(亳州市茸文堂药业有限公司,批号200708)、补中益气颗粒(北京汉典制药有限公司,批号191139)、芪斛楂颗粒[葵花药业集团(贵州宏奇),批号20190401]、胃泌素(gastrin，GAS)、胃动素(motilin，MTL)、生长抑素(somatostatin，SS；武汉华美生物工程有限公司,批号X23014011、X21014009、X22014010)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α；深圳欣博盛生物科技有限公司,批号200106-102a)、白介素-1β(interleukin，IL-1β；河南九邦生物科技有限公司,批号Nov 2020)。

1.1.2仪器 多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)、Centrifuge 5810R 型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、Step One PlusTM型实时荧光定量聚合酶链式反应仪(美国Thermofisher scientific公司)、CP124C型电子天平[奥豪斯仪器(常州)有限公司]。

1.1.3动物 雄性SD大鼠，无特定病原体(specefic pathogen free，SPF)级，体质量180～220 g，由贵州医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(黔)2018-0001。

1.2 方法

1.2.1动物分组、造模与给药 雄性SD大鼠30只，采用饮食不节、过度疲劳和苦寒破气相结合的复合因素法建立脾虚大鼠模型。造模方法参照文献[16]，于造模第1～14天，奇数日给予猪油(10 mL/kg)灌胃，并以实验鼠饲料喂养，偶数日仅以白菜喂养并使大鼠于室温下游泳至力竭；第15～21天，给予番泻叶水提物(0.5 g/kg)灌胃。取同批次未造模大鼠10只作为对照组。将造模成功的30只脾虚大鼠随机分为模型组、阳性对照组(补中益气颗粒，630 mg/kg)以及芪斛楂颗粒组(200 mg/kg)，每组10只；各组大鼠予相应药物灌胃，对照组和模型组予等量蒸馏水灌胃，每天1次，连续10 d。末次给药后24 h，水合氯醛麻醉各组大鼠，心脏采血，常温静置2 h，3 000 r/min离心15 min，取血清，保存于-20 ℃备用。

1.2.2外观行为学评分和体质量 记录各组每只大鼠的外观行为学变化，按行为评分标准[8-9]进行评分(表1)；每周称量大鼠的体质量两次，参照评分标准结合大鼠体质量变化情况，评分显著升高且体质量显著降低的大鼠评价为脾虚模型大鼠，以造模成功的大鼠进行后续试验，末次给药后按评分标准再次对各组大鼠进行评分。

表1 各组大鼠外观行为学评分标准Tab.1 Appearance and behavior evaluation scale of rats in each group

1.2.3胸腺、脾脏指数测定 采血后，脱颈椎处死大鼠，取胸腺和脾，计算胸腺、脾脏指数，脏器指数=脏器质量/大鼠体质量×100%。

1.2.4血清GAS、MTL、SS、TNF-α、IL-1β含量 取各组大鼠血清，采用ELISA法检测各组大鼠血清中GAS、MTL、SS、TNF-α、IL-1β的含量，按照各试剂盒的说明书进行操作，均使用酶标仪进行测定。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 外观行为学评分和体质量

与对照组比较，模型组大鼠外观行为学评分显著升高(P<0.01)、体质量降低(P<0.01)。与模型组比较，阳性对照组和芪斛楂颗粒组大鼠外观行为学评分值显著下降(P<0.01)、体质量增加(P<0.01)；给药结束后，阳性对照组和芪斛楂颗粒组大鼠体重已趋于正常水平，与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和图1。

表2 末次给药后各组大鼠外观行为学评分Tab.2 Appearance and behavior scores of rats in each group after the last

图1 给药期间各组大鼠体质量变化Fig.1 Changes in body mass of rats in each group during administration

2.2 胸腺、脾脏指数的影响

与对照组比较，模型组大鼠胸腺、脾指数均显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组和芪斛楂颗粒组大鼠的胸腺、脾指数升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

注：(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与模型组比较，P<0.01。图2 芪斛楂颗粒对脾虚大鼠胸腺、脾指数的影响Fig.2 Effect of qihuzha granules on thymus and spleen index in rats with spleen deficiency

2.3 血清GAS、MTL及SS水平

与对照组比较，模型组大鼠血清GAS、MTL水平显著降低(P<0.01)、SS含量显著上升(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组和芪斛楂颗粒组大鼠血清GAS、MTL水平显著升高(P<0.01)、血清SS含量显著降低(P<0.01)。见图3。

注：(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与模型组比较，P<0.01。图3 芪斛楂颗粒对脾虚模型大鼠胃肠激素的影响Fig.3 Effect of qihuzha granules on gastrointestinal hormones in rats with spleen deficiency

2.4 血清TNF-α、IL-1β水平

与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平上升(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组和芪斛楂颗粒组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平显著降低(P<0.01)。见图4。

3 讨论

中医理论中的脾是多个器官和系统的集合，除西医解剖学中的脾脏外，还包括了消化系统、免疫系统、循环系统等多个系统及器官[10]。因此，中医理论中的脾虚是指因过劳过逸、饮食不节、思虑过度等原因引起的多个器官或系统功能低下的证候。采用饮食不节、过度劳累和苦寒破气的复合因素建立脾虚大鼠模型的方法充分模拟了中医脾虚症的病因，具有脾虚症状明显、重复性高、稳定性强的特点，已成为研究脾虚症较为经典的模型[11-14]。本研究中，采用奇数日灌胃猪油、偶数日喂食白菜，使大鼠游泳至力竭，于造模第15天开始予番泻叶水提物灌胃的方法模拟脾虚大鼠模型。造模后，大鼠的体质量增长缓慢且显著低于对照组，出现食量减少、便型稀软、眯眼弓背、毛发枯燥、懒动等症状，胸腺、脾指数显著降低，反映出脾虚大鼠模型的外观行为、脏器系数的变化；而且大鼠血清GAS、MTL水平显著降低，TNF-α、IL-1β和SS显著上升，提示脾虚大鼠的胃肠功能、免疫系统有一定的受损。以上结果表明采用饮食不节、过度劳累结合苦寒破气的复合因素造模后可引起胃肠功能和免疫系统异常，从而更接近临床脾虚证侯。

注：(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与模型组比较，P<0.01。图4 芪斛楂颗粒对脾虚模型大鼠血清TNF-α和IL-1β的影响Fig.4 Effect of qihuzha granules on serum TNF-α and IL-1β in rats with spleen deficiency

本实验中，对复制成功的脾虚大鼠模型给予芪斛楂颗粒进行干预，结果显示：与模型组比较，芪斛楂颗粒组大鼠的外观行为学评分显著下降、体质量显著升高，提示芪斛楂颗粒通过缓解脾虚大鼠的外观行为学症状，使大鼠的体质量逐渐增加。

脾脏对维持机体免疫系统功能的正常运转有重要作用，研究表明脾虚证可导致机体全身和局部免疫功能低下[15]。胸腺和脾脏在维持机体正常免疫功能中，发挥了极为重要的作用[16-18]。胸腺指数、脾指数的变化能够反映脾虚模型大鼠机体免疫功能恢复的状况。TNF-α和IL-1β主要参与免疫应答、造血和炎症的调节，是机体发生细胞免疫时的关键性细胞因子，对免疫细胞的增殖与活化均有较强的作用[19]。机体在脾虚时出现免疫功能紊乱，细胞因子异常分泌，使TNF-α和IL-1β的含量增多，进一步的加重机体胃肠道等的损伤而加重脾虚的症状。本研究结果显示，经给药干预后，脾虚模型大鼠的胸腺指数和脾指数均较模型组显著上升，TNF-α和IL-1β的含量均较模型组显著下降，提示芪斛楂颗粒可能通过上调脾虚大鼠的胸腺指数和脾指数，减少血清TNF-α和IL-1β的含量来改善脾虚大鼠的免疫功能而起到保护作用。

研究表明脾虚证与胃肠道的胃肠激素分泌、胃肠免疫调节功能障碍等多种病理生理改变都有关系[20-21]。胃肠激素在调节胃肠平滑肌收缩、促进胃肠道分泌和维持胃肠道屏障等方面具有重要作用[22-23]。MTL、GAS、SS均是重要的胃肠激素，具有促进或抑制胃肠运动，加速胃肠黏膜再生的作用，三者均能很好的体现胃肠功能变化[24-25]。本研究结果显示，经芪斛楂颗粒干预后，脾虚模型大鼠血清GAS、MTL的含量较模型组在不同程度上有所上升，血清SS有所下降，提示芪斛楂颗粒改善脾虚大鼠胃肠功能可能与其调节胃肠激素的作用有关。

涂仪军[26]的研究中提到，IL-1β可导致胃肠功能紊乱，TNF-α可引起局部炎症反应。本研究中，脾虚大鼠血清中IL-1β和TNF-α的水平上升，同时GAS、MTL和SS等胃肠激素的分泌水平也出现了异常，其可能原因为脾虚证引起机体免疫功能降低，从而导致机体胃肠屏障功能低下，胃肠激素分泌异常。本研究结果显示，芪斛楂颗粒可以通过提高脾虚模型大鼠胸腺指数、脾指数、GAS、MTL含量，降低SS、TNF-α、IL-1β含量，从而改善脾虚大鼠胃肠、免疫功能。