某麋鹿保护区水源中细菌耐药基因携带情况调查

2021-12-09张含露朱丹怡万春云赵懿侔杨丰利李鹏飞

现代畜牧兽医 2021年11期

邱实，张含露，朱丹怡，吕熙，万春云，赵懿侔，杨丰利*，李鹏飞

（1．长江大学动物科学学院，湖北荆州434025；2．湖北石首麋鹿国家级自然保护区管理处，湖北石首434407）

随着人类活动及现代化农业的发展，医疗行业和畜禽养殖业中抗生素的滥用情况使得抗生素成为环境中检出频率最高的新型环境污染物，抗生素环境污染问题已成为国内外环境卫生领域的研究热点[1]。兽用抗生素被广泛使用于治疗和预防畜禽疾病，一些抗生素在动物体内吸收较差，可随动物的排泄物进入环境中，加剧了耐药菌的出现并增强了细菌的耐药性[1]。随着耐药菌传播速度加快，多重耐药细菌增多已成为全球关注的问题[2]。目前对于抗生素耐药基因的来源有2种推测：一是天然存在的耐药基因，主要是由于某些微生物在产生抗生素的同时也具有相应的耐药机制[3]；二是基因突变，由于抗生素的过量使用使细菌产生了选择并促进耐药基因的富集，让许多原本不具备耐药基因的细菌获得了新的耐药基因[4]。

本试验以某麋鹿自然保护区水源内的细菌为研究对象，检测四环素类、糖肽类、碳青霉烯类以及喹诺酮类耐药基因的携带情况。研究旨在了解保护区水源中耐药基因的携带情况，以期为后续探讨保护区周边地区耐药基因的携带情况提供依据，同时为周边地区抗生素的使用提供参考，降低耐药菌及耐药基因转移的风险。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样本来源

本试验的水源样本于2021年3月采自某麋鹿保护区内地表湖泊，设置14个采样点，每个采样点采集1份水样。使用灭菌吸管吸取距水平面以下20 cm处的地表水源，每个采样点采集10 mL水样保存于灭菌EP管中，做好标记，编号1~14。

1.1.2 试剂与耗材

LB琼脂、蛋白酶、细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；溶菌酶（合肥博美生物科技有限责任公司产品）；2×fast Pfu PCR Mix（北京佳兰生物科技有限公司）；DL2000 DNA Marker（北京聚合美生物科技有限公司产品）；琼脂糖（Biowest公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 收集菌体

分别吸取14份水源样品100µL均匀涂布于LB琼脂培养基中，37℃恒温培养18~24 h，将培养出的菌落使用0.9%生理盐水冲洗并收集于2 mL离心管中，12 000 r/min离心1 min，吸净上清收集菌体。

1.2.2 提取水样细菌基因组DNA

提取水源样本DNA，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的提取步骤进行。

1.2.3 耐药基因引物的合成（见表1）

四环素类耐药基因8种（tetA、tetC、tetL、tetM、tetO、tetW、tetB、tetX）[5-6]，糖肽类耐药基因3种（VanA、VanB、VanC）[5]，碳青霉烯类耐药基因5种（KPC、NDM、VIM、OXA-48、IPM）[7]，喹诺酮类耐药基因3种（qnrB、qnrS、qepA）[5-6]。耐药基因引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及条件见表1。引物4 000 r/min离心1 min，根据生物公司提供的参数，加入ddH2O配制成100 µmol/L的贮存液，并稀释为10 µmol/L使用，分装至EP管中－20℃保存，备用，避免反复冻融。

表1 耐药基因引物序列Tab.1 Resistance genes primer sequences

1.2.4 PCR扩增耐药基因序列

以单个耐药基因为1组，配置14个PCR体系进行耐药基因序列的扩增。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸20~60 s，共30~35个循环；72℃延伸10 min。

1.2.5 PCR产物凝胶电泳检测

取3µL PCR扩增产物，进行1.0%琼脂糖凝胶（耐药基因tetA使用2%琼脂糖凝胶）电泳检测。电泳结束观察结果，并拍照记录。

2 结果与分析

某麋鹿保护区水源中细菌耐药基因检测结果见表2。由表2可知，共检测到4种四环素类耐药基因，其中耐药基因tetA、tetB、tetO、tetX的检出率分别为7.14%（1/14）、28.57%（4/14）、7.14%（1/14）和21.43%（3/14），未检出耐药基因tetC、tetL、tetM、tetW；检测到1种糖肽类耐药基因VanA检出率为35.71%（5/14），未检测到VanB、VanC；检测到3种碳青霉烯类耐药基因，其中耐药基因NDM、KPC、VIM检出率分别为35.71%（5/14）、14.28%（2/14）、14.28%（2/14），未检测到耐药基因OXA-48及IPM。未检测到环丙沙星耐药基因qnrB、qnrS、qepA。

表2 耐药基因检测结果Tab.2 Detection result of resistance genes

3 讨论

Ji等[8]对上海地区的猪场、禽舍及养牛场内粪便样品进行四环素类耐药基因的检测，检测到tetB、tetM、tetO、tetW，与本试验中耐药基因的检出情况略有差异。何良英[9]以及Tao等[10]分别对养殖场附近污水及废水进行四环素耐药基因检测，前者发现tetA、tetO、tetW，未检测到tetB；后者发现有tetA和tetW2种耐药基因，结果均与本研究耐药基因的检出情况略有不同。张雪婧等[5]对甘肃地区某奶牛场土壤样品耐药基因的检测项中，共有7种与本试验重合的四环素耐药基因（tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetL、tetW），检出的耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetL，检出率为50%~100%，未检测到耐药基因tetX，与本试验检出情况存在差异。

VanA是最常见的耐药基因，VanA型菌株对万古霉素呈高水平耐药[11]。张雪婧等[5]试验中糖肽类耐药基因VanB、VanC的检出率均为100%，本试验中未检测到这2种耐药基因。刘利强等[12]从鲜蛋表面分离出屎肠球菌并在5株耐万古霉素的菌株中检测到了VanA基因，检出率为14.3%，低于本试验检出率。

细菌对于碳青霉烯类抗生素药物产生耐药性最主要的原因是产碳青霉烯酶水解了相应的抗生素。碳青霉烯酶最主要有5类[13]，分别为IPM、KPC、VIM、OXA-48和NDM，其中最为常见的是KPC。KPC是由blaKPC同位基因编码的A类丝氨酸类酶[14]。2017年，张雪婧等[5]并未全部检出NDM和KPC，但2018年时2种耐药基因在2个牛场检出率分别为53.55%、44.44%和27.27%、66.67%，表明耐药基因有可能在不同地区之间进行水平传播，耐药基因型分布存在区域差异性。本试验未检测到OXA-48和IPM这2种基因型，可能是由于这2种基因型在国内属于不常见的基因型[7]。水源中存在NDM、KPC和VIM等耐碳青霉烯类最常见的耐药基因，可能是由于人类的干扰，存在进入保护区时带入耐药菌的可能[15]。

本试验结果表明，该麋鹿保护区地表水源中携带有四环素类耐药基因，检出率为7.14%~28.57%；糖肽类耐药基因，检出率为35.71%；碳青霉烯类耐药基因，检出率为14.28%~35.71%。现有的耐药基因的研究表明，不同地区和不同来源性的细菌耐药基因的携带率存在差异性，且耐药基因的检出可能与检测对象耐药菌传播机制有关。不同地区抗生素的使用情况不同，对应的不同地区耐药性和耐药基因的产生可能存在差异。一般使用抗生素较多的地区耐药基因检出率更高。本试验中所检测的4类抗生素耐药基因相较畜禽养殖场等地区的耐药基因的检出率较低，采样地区为麋鹿保护区，不存在对麋鹿针对性用药的情况，故耐药基因的检出率较低。而该保护区仍能检测到耐药基因的情况与耐药菌的迁移有关，其耐药菌可能由周边地区迁移而来。