程 旭，姜 逸，高明燕，周 生，俞 燕，李建梅，沈欣悦，范建华

（中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州225125）

鸡传染性支气管炎是严重威胁养殖业的疫病之一，接种疫苗是目前最有效的预防措施。传统胚苗存在潜在外源病毒污染、病毒传代变异、后期鸡胚污染等问题，因此细胞苗是当前疫苗研发的主要方向。随着细胞需求量及产业化需要，大方瓶或转瓶已无法满足生产企业的需求。悬浮培养能够提高细胞培养的质量和病毒表达量[1]，克服了传统贴壁培养细胞生产的单批产量不高、批间差异大、产品质量不稳定、生产成本高和污染概率高等缺陷，节省人力成本，提高病毒增殖效率[2]。Vero细胞是WHO推荐兽用疫苗生产的传代细胞系，可通过生物反应器实现规模化培养。本研究采用QX型鸡传染性支气管炎病毒（IBV）毒株MJ株开展Vero细胞悬浮培养，取得最佳培养参数，为IBV细胞苗的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验细胞及毒株

Vero细胞及IBV细胞适应株MJ株均为中国农科院家禽研究所保存。

1.1.2 试剂与设备

试剂：微载体Cytodex-1（美国GE Healthcare公司）、胎牛血清DMEM（浙江天杭生物科技股份有限公司）、MEM（美国Gibco公司），其他均为国产分析纯试剂。

设备：Countess II全自动细胞计数仪（美国赛默飞公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 生物反应器及Cytodex-1的前处理

超纯水冲刷清洗干净的生物反应器2遍。烘干后在生物反应器内壁均匀涂抹甲基二氯硅烷，然后放入180℃烘干箱内2 h。室温条件下将适量的微载体Cytodex-1倒入PBS中浸泡2 h，弃掉上清，PBS冲洗2遍。

1.2.2 最佳微载体浓度试验

分别采用微载体浓度为5、10、15 g/L进行试验，于不同时间取样计数，进行5组平行试验，并对接近平均值的数据分析绘制生长曲线。

1.2.3 最佳培养基试验

生物反应器中分别以MEM、DMEM培养基培养Vero细胞，于不同时间取样，绘制生长曲线，确定最佳培养基。

1.2.4 筛选最佳血清浓度试验

确定最佳培养基的情况下，配制胎牛血清浓度分别为5%、10%、15%的培养基，生物反应器悬浮培养Vero细胞，分析并绘制生长曲线，确定血清浓度。

1.2.5 筛选最佳接种密度

将Vero细胞以30、50、80 cell/球的细胞密度接种到生物反应器中，观察细胞生长状态确定最佳细胞接种密度。

1.2.6 细胞计数

将细胞液滴入细胞计数玻片中，明场模式下使用Countess自动细胞计数仪计数。

1.2.7 IBV MJ株最佳感染复数（MOI）

以确定的最佳悬浮培养条件为基础，将IBV MJ株按MOI 0.05、0.10、0.50、1.00接入细胞，72 h后每12 h取样1次，检测TCID50，比较不同MOI下的病毒增殖情况。

1.3 数据统计与分析

数据采用SPSS 21.0进行分析，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同微载体浓度对细胞增殖的影响（见图1）

由图1可知，微载体浓度为5 g/L时细胞生长良好；微载体浓度为10 g/L时较5 g/L细胞生长速度快，72 h时显著高于5 g/L组（P＜0.05）；15 g/L组与10 g/L组差异不大。

2.2 不同培养基对细胞增殖的影响（见表1）

由表1可知，DMEM组在各时间段细胞数量显著高于MEM组，且细胞形态良好（P＜0.05）；DMEM组在48 h到72 h细胞数量明显增多。

表1 不同培养基对细胞增殖的影响Tab.1 Effect of different media on cell proliferation单位：×105/mL

2.3 不同血清浓度对细胞增殖的影响（见图2）

由图2可知，5%血清组培养至72 h有许多游离细胞，无法贴壁；10%血清组在24 h后全部吸附微载体，至72 h形成致密的细胞层；15%血清组与10%无差异。

2.4 不同接种密度对细胞增殖的影响

以筛选的微载体10 g/L、10%DMEM为基础，密度分别定为30、50、80 cell/球悬浮培养细胞。结果表明，30 cell/球组至72 h细胞数量较少仍未长满微载体，微载体利用率低；80 cell/球组由于细胞量过大，至72 h有许多游离细胞未能吸附载体，造成细胞浪费；50 cell/球组至72 h几乎所有细胞均能吸附在微载体上，生长状态良好。

2.5 不同MOI对病毒增殖的影响（见表2）

以筛选的微载体10 g/L、10%DMEM、50 cell/球为基础，MJ株按0.05、0.10、0.50、1.00接种。由表2可知，所有组在72 h后病毒效价均缓慢上升，108 h时达到峰值后下降；MOI为0.50时 在108 h病 毒 效 价 达 到6.53，高 于MOI 0.05、0.10组；MOI为1.00时，由于病毒接种量过高，病毒并不能完全吸附细胞，病毒增殖效价并不高，故MJ株最佳感染复数为0.50。

表2 不同MOI对病毒增殖的影响Tab.2 Effect of different MOI on virus proliferation单位：lgTCID50/mL

3 讨论

随着兽用疫苗的发展，细胞培养技术开始应用于生产疫苗[3]。悬浮培养利用生物反应器大规模培养细胞，整个过程中可实时控制参数，以便控制细胞生长状态[4]。悬浮培养在实现大规模培养的同时，能稳步提高产品的质量，获得优质的生物制品[5]。美国Med Immune公司使用MDCK细胞生产流感疫苗，奥地利Baxter公司利用Vero细胞培养流感疫苗[6]。国内悬浮培养技术已应用于禽流感、口蹄疫、猪圆环病毒的抗原生产[7]。以生物反应器为基础的微载体悬浮培养技术是动物疫苗生产的主流趋势，应从工艺上对细胞进行驯化，还应注意培养基优化、培养浓度及工艺等诸多因素[8]。

目前IBV弱毒活苗主要通过鸡胚连续传代致弱，但无法掌握毒株致弱程度，有毒力返强风险[9]。通过细胞系传代可有效避免风险，但IBV毒株因一直无适应的传代细胞系，制约了IBV致病机制及疫苗的研究。病毒适应细胞的能力与病毒的自然宿主、病毒原发器官和细胞类型有关。细胞在搅拌的情况下实现悬浮状态，细胞驯化难度较大，需要多代次的选择和驯化才能成功[10]。Coria等[11]报道IBV适应鸡胚后很难适应Vero细胞，若先适应鸡肾细胞后在Vero细胞上生长可能性将提高。Cunningham等[12]将IBV适应鼠脑传代后接种Vero细胞传代，病毒获得适应。本研究所获得的IBV细胞适应株MJ株是在Vero细胞上多次传代获得的。

前期研究表明，MJ株接种雏鸡后能够有效抵抗IBV强毒侵袭，具有良好的免疫原性，可作为IBV后备细胞苗的开发[13]。采用微载体悬浮培养Vero细胞进行MJ株的增殖，可为以后疫苗的产业化提供研究基础。本研究结果表明，10 g/L微载体浓度、10%DMEM培养条件下，细胞与微载体接种比例为50 cell/球时，细胞生长状态良好，微载体空球率较低。在Vero细胞悬浮培养基础上，筛选出MJ株按照MOI为0.5的感染剂量病毒扩增效率最高，108 h时病毒含量能够达到106.53TCID50/mL。

4 结论

将IBV接种Vero悬浮细胞，病毒效价较鸡胚增殖提高并不显著，可能与IBV吸附感染悬浮状态下细胞的互作机制有关，如何有效提高病毒增殖效率有待进一步研究。