沈乎醒，高卫萍，韦庆波，徐 倩

0引言

干眼是一种泪膜失去稳定性，伴有眼表不适症状的常见疾病，全球发病率约为5%～50%，我国发病率为21%～68.3%[1]。干眼的眼表不适症状，如干涩、异物感、烧灼感、刺痛感等，治疗困难，严重影响患者的工作和生活。2017年国际眼表和泪膜协会第二次会议(TFOS DEWS Ⅱ)强调干眼的主要发病机制是泪膜高渗和不稳定、眼表炎症和损伤以及神经感觉异常，年龄、性别、用眼方式、滴眼液中的防腐剂和全身性药物、隐形眼镜、眼科手术和非手术治疗都可能导致干眼[2]。未来干眼的研究需要进一步的流行病学调查以更好地确定风险因素，创造出毒性更小的药物，设计出创伤更小的眼科手术，基因组学的发展为这些研究打开了新的局面。聚合酶链式反应(PCR)和免疫印迹实验(Western blot)、基因组学等技术的广泛运用，进一步明确了干眼患者眼表细胞因子和泪液成分的变化。宏基因组学、基因工程动物、基因芯片及基因转染研究的开展，为深入研究干眼的发病机制，研发治疗干眼的新药提供了良好的条件。

1宏基因组学在干眼发病率研究中的运用

在已报告的干眼发病率调研中，超过40岁的患者约38%～68%有睑板腺功能障碍(MGD)[2]。研究表明，眼表微生物群与MGD导致的干眼密切相关，但因为泪膜的抗菌特性和泪液的机械冲刷，只有零星的眼表区域被微生物定殖，细菌培养技术有限，无法准确检测[3]。宏基因组学的技术可以分析复杂环境群落微生物，甚至包括不可培养的微生物[4]。

Li等[5]提取了35例40岁以上的干眼患者(其中25例诊断有MGD)球结膜多个部位拭子样本中细菌的DNA，并用PCR技术扩增RNA，继而采用QIIME软件对细菌16SrRNA基因V3-V4可变区进行测序，分析结膜样本中微生物群落OTU聚类及多样性。不仅区分了易致干眼的细菌以及益于眼表健康的菌落，还发现假单胞菌、巴氏杆菌等才是MGD的关键致病菌，而金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌则与MGD的发病无明显相关性。MGD导致的干眼与年龄也有关，研究指出老年小鼠MGD与人类MGD患者表现的眼表症状相似[6]。人与小鼠的基因有80%相同，Parfitt等[7]摘取3月龄和2岁共10只小鼠的睑板腺等组织，采用高通量基因测序方法读取组织中提取的DNA并制成了宏基因组文库，对不同年龄小鼠的睑板腺等组织进行差异基因表达分析，结果显示有698个基因被鉴定为差异表达，确定了包括成纤维细胞生长因子(FGF)和Wnt在内的数条信号通路在睑板腺随着年龄发生功能障碍的过程中产生重要作用，为进一步研究MGD导致干眼的机制提供了基础。IL-2受体α链(CD25)是IL-2的结合受体,CD25基因敲除(CD25KO)小鼠表现出干燥综合征(Sjögren综合征)的多种特征，包括双眼皮腺炎、眼睑腺炎和角膜结膜炎等[8]。Zaheer等[9]比较了饲养在常规和无菌条件下的CD25KO小鼠，无菌饲养的CD25KO小鼠与常规的相比，结膜杯状细胞密度降低，角膜屏障功能障碍明显，CD4+T细胞浸润增多。将野生型C57BL/6J小鼠粪便的微生物移植给无菌CD25KO小鼠，可逆转无菌CD25KO小鼠的自发性干眼表型。研究表明，体内共生微生物的缺乏可加速泪腺炎症发生、加重其严重程度，并产生了具有更强致病性的CD4+T细胞，共生微生物或其代谢产物具有保护外分泌腺的免疫调节特性。宏基因组学揭示了微生物在干眼发病原因和发病机制中的重要地位，为精确治疗干眼提供了新的靶点。

2基因芯片在干眼炎症机制研究中的运用

泪液中含有复杂的细胞因子成分，可调节多种细胞功能，也可作为干眼发生的眼表标志物和疾病康复的信号。由于泪液样本微量，ELISA只能检测样本中复杂的细胞因子中的个别因子的浓度，想要得到泪液中各种细胞因子之间相互作用和整体变化的结果，需要大量检测样本，操作繁琐，费时费力。基因芯片，又称DNA微阵列，可以通过生物发光、化学发光检测杂交探针的位置，与大量被测生物细胞或组织标记的核酸序列杂交后，实现基因信息的快速检测[10]。基因芯片技术具有高通量、高灵敏度、高特异性的特点，非常适合于同时检测微量泪液样本中的多个细胞因子[11]。

Li等[12]采用细胞因子基因芯片检测干眼模型鼠泪液中炎症因子、抗炎因子、生长因子以及其他细胞凋亡因子等，发现B7-2/Cd86、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、Fas配体、TNF-α和TIMP-1较正常水平升高。基因芯片技术也可用于分析不同疾病导致干眼的泪液成分的特异性变化，为预防继发性干眼提供早期诊断和疗效评估的实验指标。例如曾孝宇[13]通过人干眼定量抗体基因芯片(QAH-DED-1)检测糖尿病干眼患者的泪液样本，发现干眼患者泪液中EGF、IL-1RA及MIP-1d较非干眼糖尿病患者的有明显趋势变化，这些细胞因子或许可以成为糖尿病性干眼早期诊断的标志物。Gad等[14]用多重细胞因子抗体基因芯片测定配戴硅水凝胶角膜软性接触者泪液中7种细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α的浓度，显示有干眼眼部症状的配戴者促炎细胞因子IL-17A水平较高，证实了角膜软性接触镜导致的干眼眼部症状与眼表炎症有关。Zhang等[15]运用细胞因子基因芯片数据检测鬼针草水提取物对干眼模型鼠泪液中细胞因子B7-2/Cd86、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、FasL、TNF-α和TIMP-1的作用，为进一步选择合适的细胞因子进行Western blot、检验鬼针草的抗炎作用提供了便利。

3基因转染在干眼新药研究中的运用

在干眼流行病学调查中，根据症状报告得出的疾病总发病率在14.4%～24.4%，根据体征报告得出的则为1.3%～10.4%[2]，神经病理性疼痛在干眼发病机制中有重要作用，是导致干眼症状和体征分离的主要原因。干眼泪液分泌减少以及炎症均可激活角膜伤害性感受器，导致疼痛不适症状[16]。角膜的伤害感受器包括机械神经感受器、多模态-嗅觉传感器以及冷热觉感受器[17]。Yang等[18]将不同浓度的角膜冷觉TRPM8受体激动剂cryosim-3(C3，1-二异丙基膦酰基壬烷)溶液用于稳定转染人TRPM8 cDNA的中国仓鼠卵巢细胞，测试细胞内钙离子动员曲线，从而筛选有效激动剂浓度，经过鼠感觉神经元钙反应试验后，最终选取合适的cryosim-3浓度(2mg/mL)溶液用于干眼患者眼表，证实cryosim-3溶液可缓解干眼患者眼表烧灼感等不适症状，为治疗干眼提供了新型的药物和研究方法。

眼部的基因治疗具有局限性，角膜和结膜、上皮和泪膜以及如眨眼或泪膜间隙等生理机制限制了DNA有效地渗透到眼球。活性分子与纳米载体的结合，使分子能与特定的眼球结构紧密地相互作用，克服解剖和生理障碍，延长DNA在靶组织中的停留时间[19]。MUC5AC是一种具有凝胶形成特性的糖蛋白，Contreras-Ruiz等[20]将含有加载了编码修饰的MUC5AC蛋白的纳米质粒的阳离子化明胶覆盖在健康和实验性干眼小鼠的角膜上，成功地在角膜和结膜上皮细胞转染了MUC5AC蛋白，修正了干眼小鼠眼表组织MUC5AC的表达，使其眼表组织的结构和形态趋于正常，炎症因子水平下降，CD4+T细胞浸润减少，干眼症状明显减轻[21]。将基因转染技术和纳米分子材料学技术相结合，更加有效地为研发治疗干眼新药物提供了新的技术。

4基因测序在干眼手术治疗中的运用

越来越多的患者寻求眼部护理和整容手术，如长期配戴角膜镜和使用含有防腐剂的滴眼液、多次眼表手术等都可能使角膜上皮损伤、角膜缘干细胞(LESCs)功能障碍或缺损，出现干眼。症状严重者可有眼睑痉挛、剧烈疼痛，甚至失明[22]。1989/1994年先后报道了成功完成人自体LESCs移植和人同种异体LESCs移植重建角膜表面，治疗眼表损伤和LESCs缺乏[23-24]，研究人员从1997年开始进行体外扩增的LESCs研究。明确角膜上皮的表型是成功获得体外扩增LESCs的关键因素[25]。由于缺乏LESCs的特异性生物标志物和原位上皮细胞亚群的精确分子表征，这一生物工程领域的进展受到了实质性的阻碍。Bath[26]利用激光捕获显微解剖和RNA测序相结合的方法，对人类角膜上皮细胞的原位亚群进行分析，进行全局转录组分析，明确了原位角膜上皮亚群的综合分子表征，获得了适合LESCs的选择性体外扩增的有效低氧浓度和培养基，为通过培养的角膜上皮移植治疗角膜缘上皮干细胞缺乏提供了大量的数据。间充质干细胞(MSCs)被认为是值得进一步探索的可以限制组织破坏的修复细胞[27]。Lee等[28]将小鼠骨髓衍生间充质干细胞(mMSCs；1×105cells/20μL；BSS)注射到干眼模型鼠泪腺中，与注入PBS缓冲液的泪腺组织进行对比，结果显示泪腺注射mMSCs后组织中CD4+细胞浸润减少，IL-2和IFN-γ表达水平下降；睑结膜的杯状细胞的数量明显增加、黏液的分泌量也有所增加；萎缩的泪腺结构在局部灌注mMSCs后也有部分恢复，表明MSCs可以通过抑制炎症，促进组织修复来保护眼表。干细胞的培养和移植依赖在干眼领域的研究还有可以探索的广泛内容，运用好基因组学的技术，可以促进干细胞在干眼领域运用的长足进步。

5基因工程动物在干眼动物造模研究中的运用

基因工程动物的发展为复杂性状疾病的研究提供了理想的动物模型，可以在活体内分析单个候选基因的作用，将复杂的问题拆解开分析，分别对单一因素进行分析，为深入研究发病机制和基因治疗创造了条件[29]。泪腺功能障碍使泪液分泌减少，引发干燥、导致炎症反应是干眼重要的发病机制之一。

低氧诱导因子(HIF-1α)介导的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)可调控炎症因子和免疫细胞表达[30]。Ji等[31]将HIF-1α条件性基因敲除的C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠共同放置设定的干燥环境并皮下注射氢溴酸东莨菪碱(5mg/mL)诱导干眼，结果显示HIF-1α基因敲除的小鼠泪腺腺泡细胞中CD45+细胞的浸润显著增强，TRAIL基因表达水平较野生型明显降低，炎症因子IL-1β、IL-17A蛋白表达水平显著升高，诱导加速了腺泡细胞死亡。该研究为泪腺腺泡细胞衍生的TRAIL在炎症性损伤中的调节功能提供了新的见解。泪膜的稳定性对干眼眼表的健康也很重要，泪液的脂质层可维持泪膜稳定性，磷脂转移蛋白(PLTP)是人类泪液脂质层的正常成分。为了研究PLTP在泪膜稳定性中能否起到功能作用，Setälä等[32]采用野生型C57BL/6小鼠和PLTP敲除的C57BL/6小鼠，均进行干眼诱导。PLTP敲除小鼠的角膜上皮损伤、上皮羧基荧光素通透性以及闭塞素裂解较野生型小鼠明显加重。提示泪液中PLTP的存在对维持健康和功能正常的眼表是必不可少的。基因工程动物可以将干眼复杂和混合的发病机制拆解开，深入研究发病机制，为进一步研究新型的治疗药物和手段提供方法。

6结语

新一代基因组学技术使临床医生和研究人员能够从大规模研究群体中收集基因组数据量，结合新的信息学方法将多种数据与基因组数据进行集成后，更好地理解疾病机制和药物反应[33]。“精准医学”这一概念被提出后，临床上对基因组学的高通量测序技术需求越来越多。目前基因组学在干眼研究的主要侧重于细胞因子基因的转录、翻译和蛋白质-蛋白质相互作用的变化，肠道和眼表微环境菌落的多样性宏基因测序、炎症及凋亡细胞因子基因芯片检测，这些先进技术的运用为临床医生提供了较多较完善的干眼发病原因和发病机制的研究结论，利于指导临床医生制定更精准的治疗方案。此外，基因组学多重技术对治疗干眼新药和新治疗技术研发等提供科学支撑，目前已有跨学科的研究，基因组学结合材料学、网络药理学等，不仅为眼表疾病，更为难治性、遗传性眼底视网膜病变带来治疗的希望。在未来的研究中，更加侧重于基因组学对干眼发病率、组织的修复和重建的作用，为寻找更加快速有效的诊断和治疗方案以及疾病的预后提供新的思路。