李天瑜 袁晋青

(中国医学科学院北京协和医学院 国家心血管病中心 阜外医院心内科，北京 100037)

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是由肝脏合成的丝氨酸蛋白酶，通过分子内自身催化剪切后分泌到循环中，在肠道、胰腺、肾脏和发育中的中枢神经系统少量表达，参与多种生物学功能[1]。正常情况下，肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)，即载脂蛋白B/E受体与循环中的低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)结合形成LDLR-LDL复合物，通过胞吞作用进入肝细胞，随后LDLR与LDL-C解离，重新回到肝细胞表面。PCSK9与LDLR的结合使PCSK9-LDLR-LDL复合物被靶向到溶酶体降解，阻止了LDLR的重复利用，导致肝细胞表面LDLR减少，LDL-C吸收降低，血浆LDL-C水平升高。

尽管PCSK9抑制剂对心血管疾病患者的益处主要归因于显著降低LDL-C，但一些线索提示其也可能影响血小板功能和血栓形成。现对PCSK9和PCSK9抑制剂与血小板功能方面的研究进展综述如下。

1 PCSK9和PCSK9抑制剂相关研究概述

基因修饰动物模型和基因突变疾病表型证实PCSK9调节血浆LDL-C水平的作用。腺病毒诱导PCSK9过表达下调了小鼠肝脏LDLR，升高了血浆LDL-C水平；PCSK9的功能获得性突变可导致家族性高胆固醇血症，表现为高LDL-C水平和早期动脉粥样硬化；而PCSK9的功能丧失性突变则与低LDL-C水平和低心血管风险有关。因此，抑制PCSK9成为降低血浆LDL-C水平的新策略。目前已有的PCSK9抑制剂包括单克隆抗体、疫苗、类抗体支架蛋白类药物、多肽、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和小分子抑制剂等。单克隆抗体是研究最成熟的PCSK9抑制剂，在降低血浆LDL-C水平，延缓动脉粥样硬化进展，减少心血管事件[2-3](心肌梗死、卒中和不稳定型心绞痛/血运重建)方面显示出优异的疗效。两种全人源单克隆抗体evolocumab和alirocumab已投入临床使用，作为心血管疾病患者的二级预防和原发性高脂血症(包括杂合子家族性高胆固醇血症)患者进一步降低LDL-C的辅助治疗；此外，evolocumab还可作为纯合子家族性高胆固醇血症患者进一步降低LDL-C的辅助治疗。

除了evolocumab和alirocumab已用于临床外，其他研发中的单克隆抗体包括LY3015014[4]和RG7652[5]。疫苗可引起PCSK9自身抗体的产生，已有两种疫苗在动物研究中显示出显著降低胆固醇、抗血管炎症和抗动脉粥样硬化的作用[6-7]。BMS-962476是一种Adnectin类PCSK9抑制剂(属于类抗体支架蛋白类药物)，能迅速降低PCSK9和LDL-C水平[8]。此外，某些合成多肽也能阻止PCSK9与LDLR结合，其对血浆LDL-C水平的影响有待进一步研究[9-10]。与上述在细胞外影响PCSK9功能的抑制剂不同，inclisiran是一种siRNA，在肝细胞内诱导PCSK9信使RNA(messenger RNA，mRNA)裂解，抑制PCSK9合成，每年需两次给药即可长期和显著地降低LDL-C，最近发表的临床试验结果为inclisiran在临床使用中的安全性提供了证据支持[11]。此外，胆固醇酯转移蛋白抑制剂(如K-312和10-去氢姜二酮)也能进入肝细胞，影响PCSK9启动子活性，抑制PCSK9合成，降低PCSK9和LDL-C水平[12-13]。

2 PCSK9和PCSK9抑制剂与血小板功能的相关性

有研究发现血浆PCSK9水平与血小板计数和血小板压积呈正相关[14]，后者能反映残余血小板反应性。ATHERO-AF研究[15]发现，心房颤动患者血浆PCSK9水平与尿液11-去氢-血栓烷B2水平相关，后者是反映体内血小板活化的指标，能预测心血管事件的风险，随访结果证实血浆PCSK9水平与心房颤动患者的心血管事件(包括心源性死亡、心肌梗死、血运重建、缺血性脑卒中及短暂性脑缺血发作)相关。PCSK9-REACT研究[16]观察了经皮冠脉介入术后服用替格瑞洛或普拉格雷的急性冠脉综合征患者，发现血浆PCSK9水平升高与血小板反应性升高明显相关，随访结果显示高PCSK9患者的心血管事件(心源性死亡、心肌梗死、不稳定型心绞痛、血运重建、支架内血栓及缺血性脑卒中)发生率显著高于低水平PCSK9患者(22.03% vs 3.39%，HR2.62，95%CI1.24～5.52)。Camera等[17]通过氯化铁诱导小鼠颈动脉损伤来评估PCSK9对动脉血栓形成的影响，结果发现与PCSK9+/+小鼠相比，PCSK9-/-小鼠颈动脉血栓形成减少，且为不稳定的非阻塞性血栓，进一步检测血小板活化标志物发现，糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体激活、P选择素表达及血小板-白细胞复合物生成均显著减少。在体外将PCSK9与血小板共同孵育可增强阈值以下肾上腺素诱导的聚集[17]，直接证明了PCSK9对血小板功能的正向调节作用。

此外，冠心病患者活化的血小板能释放sortilin[18]，该蛋白可促进PCSK9的分泌，在两项回顾性研究及大鼠心肌梗死模型中均观察到心肌梗死急性期血浆PCSK9水平短暂性升高[19-20]。据此推测PCSK9分泌与血小板活化相互放大的恶性循环可能促进了心血管事件的发生和发展。

上述研究结果表明，PCSK9可能通过增强血小板的活化和聚集，参与动脉粥样硬化血栓形成事件的发生，PCSK9抑制剂对血小板功能的影响可能是其降低心血管事件发生率的原因之一。

一项前瞻性队列研究[21]评估了PCSK9单克隆抗体对家族性高胆固醇血症患者血小板功能的影响，研究表明evolocumab或alirocumab治疗2～12个月后，血小板活化和聚集显著减少，血小板对阿司匹林抑制作用的敏感性显著提高。一项针对健康汉族人群的研究发现，PCSK9的单核苷酸多态性rs2495477显著影响普拉格雷的药代动力学[22]，以上研究结果为PCSK9抑制剂在改善血小板高反应性方面的应用提供了思路。

冠心病合并2型糖尿病患者，其血小板中PCSK9含量是健康人群、单纯糖尿病患者和单纯冠心病患者的两倍[23]，以此推测血小板中PCSK9含量可能与2型糖尿病相关的血小板活化增加和血小板高反应性有关。PCSK9抑制剂是否对冠心病合并2型糖尿病患者的血小板功能有额外的抑制作用及相关机制，仍需进一步探索研究。

3 PCSK9抑制剂对血小板功能的直接影响

血小板表达Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)-2和TLR-4配体可通过激活TLR/核因子κB(NF-κB)通路引起血小板活化。PCSK9可上调巨噬细胞表达TLR-4，增强TLR/NF-κB通路介导的炎症因子释放[24]，可假设PCSK9能通过上调血小板TLR的表达促进血小板活化。最近一项研究发现将血小板与PCSK9共同孵育时，PCSK9能引起剂量依赖性的血小板活化，这一作用可被分化簇36(cluster of differentiation 36，CD36)和NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)抑制剂所抑制，表明PCSK9通过与CD36结合直接作用于血小板，引起NOX2介导的血小板活化，LDL的存在可放大这一作用[25]。另外，血小板中PCSK9含量升高可能与血小板活化增加和血小板高反应性相关[23]。人血小板中未发现PCSK9 mRNA，而巨核细胞表达少量的PCSK9 mRNA，因此血小板中的PCSK9可能来自于巨核细胞[26]，以上研究提示PCSK9抑制剂可能通过抑制PCSK9对血小板的作用，干扰PCSK9的合成而直接影响血小板功能。

4 PCSK9抑制剂对血小板功能的间接影响

血脂异常可影响血小板功能。PCSK9抑制剂除了显著地降低血浆LDL-C水平外，还能调节脂蛋白a[lipoprotein(a)，Lp(a)]和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)等脂质的血浆水平，因此PCSK9抑制剂可能通过对多种脂质的调节间接影响血小板功能。

4.1 胆固醇

血小板质膜中胆固醇的积聚可能会改变膜结构并影响膜受体的信号传导[27]，增强血小板对激动剂的反应；反之，质膜中胆固醇的消耗则引起血小板对激动剂的反应下降。此外，Panes等[28]观察到高胆固醇血症患者的血小板膜胆固醇含量更高，血小板组织因子及活化凝血因子Ⅹ增多，表明膜胆固醇含量与血小板促凝活性相关，使用瑞舒伐他汀治疗可减少血小板膜胆固醇含量并降低其促凝活性。值得注意的是，该研究并未观察到他汀类药物治疗影响血小板对低浓度激动剂的反应性，提示调节血小板促凝活性能预防动脉血栓形成而不增加出血风险。PCSK9抑制剂能显著地减少血浆胆固醇，可能具有类似的耗竭血小板膜胆固醇和降低血小板活性的作用。

4.2 LDL

天然LDL(native LDL，n-LDL)和氧化型LDL(oxidized LDL，ox-LDL)都可调节血小板功能，其中ox-LDL起主要作用。循环中的n-LDL与血小板表面的载脂蛋白E受体2结合，促进血栓烷A2产生从而激活血小板，但这一过程是暂时性的，因为n-LDL与血小板内皮细胞黏附分子-1的结合抑制了上述反应[29]。ox-LDL则通过提高血小板活性，增强炎症反应，促进内皮细胞与血小板黏附等多种途径影响血小板功能。

ox-LDL提高血小板活性主要是通过与CD36结合，增加血小板内NOX2介导的活性氧合成，降低环鸟苷酸抑制信号的强度，导致血小板功能亢进[30]。此外，TLR-2和TLR-6与高脂血症相关的血小板功能亢进相关，其中TLR-2可能通过独立于CD36的途径增加血小板的反应性[31]。活化的血小板表达凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized LDL receptor-1，LOX-1)，使用LOX-1抑制剂可显著地抑制血小板聚集[32]。以上研究提示ox-LDL与血小板TLR和LOX-1结合能增强血小板功能，而活化的血小板本身也可将n-LDL氧化为ox-LDL，形成正反馈通路[33]。PCSK9抑制剂可通过下调血浆ox-LDL水平，减弱后者对血小板活化的促进作用，同时中断血小板活化-ox-LDL生成的恶性循环。在急性冠脉综合征患者中观察到ox-LDL与血小板的结合增加[34]，说明ox-LDL可能在急性血栓形成中起作用，这为PCSK9抑制剂在动脉血栓性事件急性期潜在的保护作用提供了理论支持。

ox-LDL激活巨噬细胞LOX-1，通过NF-κB通路促进炎症因子的分泌和PCSK9的表达[35]，PCSK9也可反过来增强ox-LDL诱导巨噬细胞释放炎症因子，使用PCSK9 siRNA能抑制ox-LDL对巨噬细胞的促炎作用。ox-LDL结合内皮细胞LOX-1引起内皮功能障碍[32]，使内皮表现为促凝特性。内皮细胞上的LOX-1还可直接介导血小板黏附[32]。研究显示PCSK9和LOX-1可正向调节彼此的表达[35]，因此，除了降低血浆ox-LDL水平，PCSK9抑制剂还可通过下调LOX-1的表达减轻其促炎症相关性血栓形成的作用。

4.3 Lp(a)

Lp(a)是氧化磷脂(oxidized phospholipids，oxPL)的主要载体，oxPL通过作用于TLR-2激活血小板[36]。然而Lp(a)对血小板功能的直接影响尚存争议。已知多种受体可介导Lp(a)的清除，包括LDLR、脂蛋白受体相关蛋白1和清道夫受体-B1等，PCSK9可介导这些受体的降解，因此使用PCSK9抑制剂可显著降低血浆Lp(a)水平，从而减少oxPL对血小板的刺激。

4.4 HDL

HDL可通过非受体依赖的机制促进血小板膜胆固醇的流出[37]。此外，HDL与ApoER2结合增加了血小板一氧化氮的合成，上调血小板内环鸟苷酸，从而抑制血小板聚集[38]。天然HDL和氧化型HDL均可结合清道夫受体-B1影响血小板功能，且氧化型HDL能更有效地抑制胶原、二磷酸腺苷和凝血酶诱导的血小板聚集[39]，PCSK9抑制剂可能通过升高血浆HDL水平间接调节血小板功能。

5 小结与展望

PCSK9单克隆抗体在降低血浆LDL-C水平，延缓动脉粥样硬化进展和减少心血管事件方面疗效显著。疫苗、类抗体支架蛋白类药物、胆固醇酯转移蛋白抑制剂及siRNA等已在动物实验或临床试验中显示了初步疗效，与单克隆抗体相比，可能具有价格低廉和给药次数少等优势，是未来有望应用于临床的PCSK9抑制剂。越来越多的证据表明PCSK9抑制剂降低心血管事件的作用可能部分归因于其对血小板功能的影响。PCSK9抑制剂能直接或间接地影响血小板功能，可能的机制包括抑制PCSK9对血小板的作用，减少血小板PCSK9含量，减少血小板膜胆固醇，降低LDL和Lp(a)对血小板活化的促进作用，增强HDL对血小板聚集的抑制，减轻巨噬细胞和内皮细胞的促炎症相关血栓形成作用。

阐明PCSK9抑制剂对血小板功能的影响可能会拓宽这类药物的适应证，如PCSK9抑制剂可作为辅助抗血小板药物用于合并高脂血症和糖尿病等血小板活性升高的代谢性疾病的患者，改善血小板对阿司匹林和氯吡格雷等经典抗血小板药物的高反应性。另外，由于在急性冠脉综合征患者中观察到血浆PCSK9水平的升高和ox-LDL与血小板结合的增加，PCSK9抑制剂在缺血性心血管疾病急性期治疗中的潜在作用也是值得研究的方向。