卓泽文，林彦汐，李名志，杨自兵，朱丽婷，孔令保， 王 婷（江西农业大学生物科学与工程学院 330045）

流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）引起的一种蚊媒性人兽共患传染病[1，2]，在我国属乙类传染病，每年夏秋季重点传染病防控、灾后疫情防控都将其列为重点。另一方面，JEV给养猪业造成了很大的经济损失，仔猪、种猪、母猪感染后会导致繁殖障碍、流产甚至死亡[3，4]。近年来，随着养猪集约化程度的提升，大中型养猪企业受养殖量大、物流运输广等因素影响，致使多种病原菌混合感染、新病原菌感染、病原菌突变种感染等情况多发，难以判断致病原因，因此急需一种特异性强、灵敏度高、操作简便、成本较低的诊断方法。

2000年，Notomi T等[5]在《Nucleic Acids Research》上报道了一种环介导等温扩增（LAMP）技术，该方法通过采用具有高链置换活性的Bst DNA聚合酶，针对目的基因上的六段区域设计四条引物，在等温条件下、1h左右，高效、特异地扩增目的基因，反应结果可视化。一直以来，LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、反应时间短、设备简单且鉴定便捷及时而受到研究人员青睐[6-11]。此项技术经过20年的发展，在指示剂、辅助剂、储存方法等方面得到了极大的发展[8-16]。特别是Bst 3.0 DNA聚合酶，加入了逆转录酶活性。因此本试验基于实验室保存的相关材料，以JEV P3病毒株为模板，使用Bst 3.0 DNA聚合酶利用RT-LAMP技术进行反应，建立一种新型、灵敏、快速、实用的JEV检测方法。

1 材料与方法

1.1 生物材料

JEV P3病毒株，BHK-21细胞，E.coli DH5α菌株，pET-28a-LTB-NS1重组质粒均由本实验室保藏。

1.2 主要试剂

质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；TRIzol RNA分离试剂购自Ambion公司；甜菜碱、钙黄绿素、DMSO购自Solarbio公司；100mmol· L-1MnCl2溶液购自Sigma公司；2k DNA Marker购自康体生命科技有限公司；逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、核酸电泳10× Loading buffer购自TaKaRa公司；Bst 3.0 DNA聚合酶及其缓冲液、100mmol· L-1MgSO4购自NEB公司；2.5mmol· L-1dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖购自GenStar公司；DEPC水购自生工生物工程（上海）股份有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇购自西陇化工股份有限公司。

1.3 仪器设备

PCR仪——美国Bio-Rad公司；凝胶成像分析系统——上海勤翔科学仪器有限公司；琼脂糖水平电泳仪——上海天能科技有限公司。

1.4 引物设计与合成

根据实验室已有的生物材料，将JEV NS1序列导入在线设计软件Primer Explorer V5 （http: //primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.htmL）设计并筛选出一组LAMP引物，引物序列为JEV-F3 5′-GCGGAGTCAGATCTGTCACT-3’， JEV-B3 5’-TTCCGGGGCAAAGAGGAT-3’， JEV-FIP 5’-ACCACACTGAGGTCCACTGCATTCACCAAATGTGGGAAGCCGTAAG-3’和JEV-BIP 5’-TATCGCTCAGCCCCTAAACGCCTTCCCCATGCTTTCCAGCC-3’。扩增片段长度为217bp， 引物由北京擎科生物科技有限公司合成，工作浓度为10μmol· L-1。

1.5 模板的提取及PCR和RT-PCR检测

提取E.coli DH5α-pET-28a-LTB-NS1重组质粒，质粒的提取参照质粒小提试剂盒说明书，并保存在-20℃冰箱；以NS1重组质粒为模板，分别以内引物和外引物做PCR反应，检测引物的特异性。采用TRIZOL法提取JEV P3病毒株核酸，利用cDNA Mix逆转录试剂盒获得JEV cDNA，然后以JEV cDNA为模板，利用设计的内引物和外引物进行PCR反应。

外引物PCR体系为: 2× Cata Amp Taq PCR Mix 10μL，外引物0.4μL，模板0.4μL，补加ddH2O至20μL。反应程序为: 94℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min，37℃ 10s。内引物PCR体系为: 2× Cata Amp Taq PCR Mix 10μL，内引物0.4μL，模板0.4μL，补加ddH2O至20μL。反应程序为: 94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃30s，35个循环；72℃ 10min，37℃ 10s。反应结束后，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，缓冲溶液为TAE溶液。

1.6 LAMP反应体系及反应条件的优化

LAMP反应体系成分包括: 外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、dNTPs、Bst 3.0 DNA 聚合酶、10×等温扩增缓冲液Ⅱ（1×缓冲溶液含2mmol· L-1MgSO4）、MgSO4、甜菜碱、模板、ddH2O。Bst 3.0 DNA聚合酶使用说明书推荐的LAMP反应体系中各组分终浓度分别为: 1×等温扩增缓冲液Ⅱ（含2mmol·L-1MgSO4）、6mmol· L-1MgSO4（共 计8mmol· L-1MgSO4）、0.2μmol· L-1外引物F3/B3、1.6μmol· L-1内引物FIP/BIP、0.32U·μL-1Bst 3.0 DNA聚合酶，1.4mmol· L-1dNTPs、DNA或RNA模板＞10拷贝。

以Bst 3.0 DNA聚合酶使用说明书推荐的体系为基础，并结合相关文献报道[3，4，14，18，21]，以质粒DNA为模板，采取单因素试验，对反应温度（65、66、67、68、69、70℃）、甜菜碱浓度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mol· L-1）、Mg2+浓度（4、6、8、10mmol· L-1）、Bst 3.0 DNA聚 合 酶 浓 度（0.08、0.16、0.24、0.32U·μL-1）等进行优化，确定最佳的反应体系。

1.7 可视化检测的建立

本试验采用钙黄绿素-MnCl2作为可视化指示剂，钙黄绿素溶于DMSO后再稀释至工作浓度。依据已有的文献报道[14]及反应前后颜色深浅的比较，确定MnCl2的终浓度为0.5mmol·L-1，钙黄绿素终浓度为40μmol· L-1。

1.8 JEV-RT-LAMP检测

BHK-21细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，铺满密度约80%时接种JEV P3株病毒，约80% 细胞出现病变时收获细胞，提取样本总RNA并立即加入LAMP反应体系进行反应，验证LAMP反应体系的可行性。

2 结果与分析

2.1 引物特异性验证

为了验证针对JEV NS1设计的引物的特异性，分别以NS1重组质粒和JEV P3病毒株的cDNA为模板进行PCR扩增，另外以ddH2O为阴性对照，结果（图1）显示以NS1质粒（泳道2和5）和JEV cDNA（泳道3和6）为模板时扩增得到条带，而阴性对照组（泳道1和4）未出现条带，表明设计的引物与模板均能够很好的匹配。

图1 模板材料验证

2.2 LAMP反应体系条件的优化

以JEV NS1重组质粒为模板，ddH2O为阴性对照，采取单因素试验，对反应温度（65、66、67、68、69、70℃）、甜菜碱 浓 度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mol· L-1）、Mg2+浓 度（4、6、8、10mmol· L-1）、Bst 3.0 DNA聚合酶浓度（0.08、0.16、0.24、0.32U·μL-1）进行优化。反应1h后，80℃ 5min终止反应；置于4℃冰箱冷却10min后用2%琼脂糖凝胶电泳，缓冲溶液为TAE溶液。

根据凝胶电泳结果显示，最佳反应温度为67℃（图2）；最佳甜菜碱浓度为0.8mol· L-1（图3）；最佳Mg2+浓度为4mmol· L-1（图4）；最佳酶终浓度为0.32U·μL-1（图5）。

图2 LAMP反应温度优化

图3 甜菜碱终浓度优化

图4 Mg2+浓度优化

图5 酶终浓度优化

通过上述试验探索确定了LAMP反应的最佳体系。在20μL的体系中，各组分终浓度分别为: 1×等温扩增缓冲液Ⅱ（含2mmol· L-1Mg2+）、0.2μmol· L-1外引物F3/B3、1.6μmol·L-1内引物FIP/BIP、0.8mol· L-1甜菜碱、0.32U·μL-1Bst 3.0 DNA聚合酶、2mmol· L-1MgSO4，2μL dNTPs、0.5μL模板，补加ddH2O至20μL。

2.3 可视化检测的建立

在体系中加入钙黄绿素-MnCl2指示剂，阴性结果为橘黄色，阳性结果为绿色，通过配以绿色背景可以增加色差，辅助判断（图6）。

图6 可视化检测的建立

2.4 JEV-RT-LAMP检测

提取接种JEV P3病毒株的BHK-21细胞总RNA，立即加入LAMP反应体系进行反应，以DEPC水为阴性对照，使用3%琼脂糖凝胶电泳，结果显示LAMP体系能够实现对JEV核酸的一步快速检测（图7）。

图7 JEV病毒核酸RT-LAMP检测

3 讨论

JEV严重危害我国人畜健康，虽然自2007年起，乙脑疫苗加入国家免疫规划，有效地降低了我国乙型脑炎发病率，但由于我国的气候条件、农业生产等诸多因素影响，个别省份的乙型脑炎发病率并未明显下降，在2014年中国疾控中心就表示部分地区乙脑反弹的情况，并且我国JEV的流行株也从基因Ⅲ型转为基因Ⅰ型[17]，因此研发一种新型的JEV快速检测试剂十分必要。

而目前商业诊断试剂市场上针对JEV的血清学检测的诊断效果有限，且成本高昂。核酸检测成本较低，但常规RT-PCR和real-time PCR等仍存在着时间长、操作复杂的问题。这些方法都需要配备十分昂贵的相关精密仪器设备，人员也要经过技术培训，限制了它们在病毒快速诊断中的应用，很难在野外、灾区、基层实验室和猪场推广使用。而LAMP技术的提出打破传统核酸扩增技术需要温度循环的常规，十分符合WHO制定的“ASSURED”诊断试剂标准，为核酸扩增技术普及、条件不足的基层开展现场检测提供了方便[3，4]。

JEV属于RNA病毒，传统的LAMP反应使用的Bst DNA聚合酶没有逆转录活性，以往包括近些年的一些研究都是通过混合逆转录酶实现对JEV核酸的检测，如杜鹃[4]等研究者以LAMP技术为核心建立了两步法和一步法两种检测JEV的方法，周玉鹏等[18]也建立了检测基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的RTLAMP方法。而Bst 3.0 DNA聚合酶的出现能够直接针对RNA进行逆转录等温扩增，使检测更加便捷高效[19]，但相关报道不多。Silva等[19，20]使用Bst 3.0 DNA聚合酶实现对寨卡病毒的RT-LAMP检测，表示Bst 3.0 DNA聚合酶在RNA酶抑制剂存在的条件下依然不影响其活性；高彦萍等[21]使用Bst 3.0 DNA聚合酶实现对马铃薯卷叶病毒的RT-LAMP检测，但凝胶电泳显示梯状条纹并不清晰。因此本研究通过试验，进一步明确了Bst 3.0 DNA聚合酶的高逆转录活性和DNA聚合酶活性。

关于LAMP检测的高特异性和高灵敏度方面，已经有大量文献证实[4-10，12，19，20]，在指示剂、辅助剂、储存方法等方面的发展也有大量文献报道[8-10，12-16]，本文不在赘述。本试验前期依据Notomi T等[5]在《Nucleic Acids Research》上发表的原始文献设计引物，极易形成引物二聚体，加之65℃左右的恒温不足以打开NS1质粒的双链，LAMP反应过程又极易造成气溶胶污染，对结果判定造成极大干扰。因此我们认为，在准备LAMP实验过程中，引物的设计极为重要，应当避免引物间3′端配对，产生引物二聚体。实验过程中，应当将电泳区与体系的反应与配制区分开，反应完成后置于4℃静置10min后再电泳，这些举措能够减少气溶胶的产生和对实验造成的污染。甜菜碱对LAMP的辅助能力，不同文献评价不一[4，14，21]，本试验结果表明甜菜碱对LAMP反应有着积极的作用，能够使反应效率提升。

4 结论

综上所述，本试验建立的新方法通过使用高逆转录活性和DNA聚合酶活性的Bst 3.0 DNA聚合酶，实现乙脑病毒RNA核酸的一步快速检测，为研制一款灵敏度高、特异性强、检测成本低、可在猪场和基层实验室简单操作的JEV快速检测试剂盒提供了重要的参考，也为今后研发针对RNA病毒核酸的高效检测方法提供了经验。