王芹 朱莹 刘卉 胡静静

江苏卫生健康职业学院，江苏 南京 211800

HIV 在全球广泛流行，到目前为止，已导致3200多万人死亡。据世界卫生组织统计，截至2018 年底，约有3790 万艾滋病毒感染者［1］。没有针对艾滋病毒感染的治愈方法，但通过抗逆转录药物使病毒得到控制是最有效的方法，大部分的HIV 感染者不能接受价格高昂的逆转录酶抑制剂，因此寻找高效且毒性较低的新型抗艾滋病毒药物是目前研究的热点。

NF1 菌多糖是从NF1 细菌中提取并对其进行硫酸化修饰，分子量20~200kDa。NF1 菌多糖主要由1，3-脱水葡萄糖、少量低聚糖和其他糖类组成。研究发现，香菇多糖、冬虫夏草多糖、猪岑多糖、板蓝根多糖等具有多种生物活性，比如增强免疫功能、抗肿瘤、抗凝血等［2］。但是很少报道关于从细菌中提取的多糖对HIV的抑制作用。本研究采用NF1 菌多糖进行体外抗HIV-1 活性试验，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器 细胞培养瓶及培养板（Costar 公司和Graner公司），超净工作台（LABCONCO 公司），二氧化碳恒温培养箱（Thermo 公司），倒置显微镜（XDS-1B，重庆光电仪器有限公司），超速冷冻离心机（5804R，Eppendorf 公司），超低温冰箱（Thermo 公司），电热恒温水浴箱（HH-4，江苏金坛市荣华仪器厂），精密电子天平（BS124S，Sartorius 公司），96 孔酶标板（2897，Corning 公司），酶标定量测定仪（SYNERGYHT，Bio-TeK 公司）。

1.2 主要试剂 裂解液和荧光素酶检测试剂盒（Promega 公司），DMEM 培养基，胎牛血清（GIBCO 公司），PEI 转染试剂，DEAE-dextran，MTT（Sigma 公司）。

1.3 细胞及病毒质粒 Env 质粒和PNL4-3 质粒，293T细胞、GHOST 细胞以含10%胎牛血清的DMEM 培养基常规培养。

1.4 方法

1.4.1 对GHOST 细胞的毒性作用。采用MTT 法，在96孔板的每个孔加入1.0×105/mL 的GHOST 细胞悬液100μL，与不同浓度（10000μg/mL、2000μg/mL、400μg/mL、80μg/mL、16μg/mL 及 3.2μg/mL）的 NF1 菌多糖溶液混合，设6 个重复孔，同时设置不含药物的对照孔，37℃，5%的CO2培养箱培育48h，采用MTT 比色法检测细胞毒性。酶标仪检测470nm 吸光值，计算细胞生长抑制率。

1.4.2 体外抗HIV-1 活性检测。用已报道的PNL4-3 质粒和 Env 质粒共转染 293T 细胞产生 Env 假病毒［3］，并对病毒液进行病毒滴度的测定［4］。假病毒感染GHOST 细胞导致荧光素酶的表达，且荧光素酶的活性与感染的病毒数量成正比，可通过检测荧光值来确定病毒感染数量，检测NF1 菌多糖对 R5 型毒株 JR-FL 和 X4 型毒株 HXB-2 的抑制作用，步骤如下：在96 孔板的每个孔中加入100μL不同浓度的用DMEM 培养基稀释的NF1 菌多糖，每个浓度重复4 个孔，每孔加入200TCID50 的病毒液50μL，加入 100μL 含 DEAE 的 105/mL 的 GHOST 细胞悬液，37℃，5%的CO2培养箱培养48h。弃去培养液，每孔加入100μL裂解液，测荧光值，计算病毒抑制率。治疗指数（T1）＝半数细胞毒性浓度（CC50）/半数抑制浓度（IC50）。

1.4.3 时间递加分析试验。为了进一步验证NF1 菌多糖是在病毒入胞前还是入胞后起作用，用HIV 的入胞抑制剂Dextran sulfate，逆转录酶抑制剂nevirapine 和AZT 作为对照药物，利用对病毒起作用的时间不同来检测［5］。GHOST 细胞按 104/孔接种于 96 孔板，37℃培养过夜。更换新鲜培养基后，每孔加入26.7μg/mL 的NF1 菌多糖，同时加入阳性对照药物0.5μg/mL 的AZT，100μg/mL 的 Dextran sulfate，2ug/mL 的 nevirapine和标准对照同等体积的培养基。各孔加入JR-FL 病毒液，依次在 1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、12h、24h 加入NF1 菌多糖，AZT，Dextran sulfate，nevirapine，新鲜培养基，每组设4 个复孔。37℃培养箱培养48h 后检测荧光值，计算病毒抑制率，绘制不同药物各个时间点的病毒抑制曲线。

1.5 统计学分析 采用SPSS 20.0 进行数据统计与分析，实验结果数据以表示，多组均数比较采用ANOVA 方法，组间两两比较采用Dunnett-t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF1 菌多糖对GHOST 细胞毒性作用 NF1 菌多糖低浓度时对GHOST 细胞的毒性作用较小，NF1 菌多糖浓度为50μg/mL 时，对细胞没有明显的毒性作用（P>0.05），CC50约为 760μg/mL。见表 1。

表1 NF1 菌多糖对GHOST 细胞毒性

2.2 NF1 菌多糖抗HIV-1 假病毒活性 在GHOST 细胞上检测了NF1 菌多糖对R5 毒株JR-FL 和X4 型毒株HXB-2 的抑制作用，随着NF1 菌多糖浓度的增大，对HIV-1 的抑制作用越明显，NF1 菌多糖抑制JR-FL毒 株的 IC50为 4.67μg/mL， 抑 制 HXB-2 的 IC50为6.75μg/mL。见表 2。

表2 NF1 菌多糖对HIV-1 假病毒毒株的抑制作用（μg/mL）

2.3 时间递加分析试验 非核苷类逆转录酶抑制剂nevirapine 和核苷类逆转录酶抑制剂AZT 具有极为相似的曲线，而NF1 菌多糖和入胞抑制剂Dextran sulfate具有很相似的趋势。在病毒感染2h 后，已经有部分病毒不能被NF1 菌多糖和Dextran sulfate 阻止，在病毒感染5h 以后，加入NF1 菌多糖和Dextran sulfate，基本能够抑制60%的病毒，而两种逆转录酶抑制剂可以抑制病毒感染一直到8h。因此，NF1 菌多糖和Dextran sulfate 一样都是入胞抑制剂。见图1。

图1 时间递加分析实验

3 讨论

艾滋病严重威胁着人类健康，每年有上百万患者死于与艾滋病相关的疾病。高效联合抗逆转录病毒（HARRT）虽然极大的延长了患者的寿命，但其不能彻底从患者体内清除HIV 病毒，而且其价格昂贵，随着耐多药的HIV 的出现，使得研发新型的抗HIV 药物势在必行［6］。本研究采用了MTT 法检测NF1 菌多糖对细胞的毒性，采用了假病毒系统测试了NF1 菌多糖对HIV-1 的抑制作用，通过检测GHOST 细胞荧光素酶的表达水平，来评价病毒的感染情况，进而评价药物抗病毒效果，该系统检测结果稳定，可重复性好［7］。

通过本试验研究，MTT 法检测NF1 菌多糖对GHOST 的毒性，CC50为 760μg/mL，在 NF1 菌多糖浓度为26.7μg/mL 时，已经能够抑制90%以上的R5 毒株JR-FL；浓度为29.5μg/mL 时，已能够抑制90%以上的X4 毒株HXB-2，而GHOST 细胞有80%以上的存活率，表明NF1 菌多糖对HIV-1 的抑制作用不是由于对GHOST的毒性引起的，说明NF1 菌多糖对HIV-1 有较好的抑制作用。其对GHOST 细胞的毒性，CC50约为 760μg/mL，抑制JR-FL 毒株的 IC50为4.67μg/mL，T1为 162.7；抑制 HXB-2 毒株的 IC50为 6.75μg/mL，T1为 112.6。这个结果表明，NF1 菌多糖对细胞毒性小，抗HIV-1 的活性明显。为了进一步研究NF1 菌多糖体外抗HIV-1 的潜在靶点，我们进行了时间点加药实验，结果显示，NF1 菌多糖为一种入胞抑制剂，作用于HIV 感染的早期。

综上所述，本研究表明NF1 菌多糖具有体外抗HIV-1 的活性，其潜在的作用靶点是在HIV 感染的早期，而且NF1 菌多糖水溶性很好，具有潜在的开发利用价值。