胡朝暾， 周爱芳， 戴柏倩， 于梦婷

（怀化学院1.生物与食品工程学院；2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化418008）

蜘蛛毒腺是一种高度特化且对蜘蛛生存至关重要的器官，能够产生、分泌和储存毒液.研究表明绝大多数的蜘蛛毒素是一类具有3—5对二硫键，主要作用于细胞膜上离子通道且具有特定药理活性的多肽类毒素[1，2].由于蜘蛛毒素特定的作用部位和活性功能，其具有开发为治疗某些疾病的新型药物、杀虫剂和神经生物学工具试剂的潜能[3，4].因此，蜘蛛毒素引起了科学界、农业和制药行业的广泛关注[5，6].

家福捕鸟蛛是一种近年来发现的蜘蛛新种，其栖息地主要分布在我国的广西、云南等地.前期我们对家福捕鸟蛛毒素进行了较系统的研究.研究发现家福捕鸟蛛毒液成分复杂，已鉴定到几百个毒素分子.而且研究发现家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞TTX-R钠通道具有抑制作用，表明粗毒中存在对TTX-R通道具有抑制活性的毒素分子[7].通过RP-HPLC和膜片钳活性测定，从其粗毒中分离鉴定到1个对TTX-R钠电流具有明显抑制作的毒素分子（JFTX-22），并进行了JFTX-22的基本理化性质分析、空间结构预测和同源序列比对.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：家福捕鸟蛛采自广西宁明县桐棉镇和爱店镇的山区，SD大鼠购自湘雅医学院动物养殖中心.

1.1.2 试剂：Sigma公司的葡萄糖、D-glucose、NaOH、KCl、冰乙酸、氯化铯、MgCl2、EGTA、三氟乙酸、胰蛋白酶抑制剂、α-氰基-4-羟基-肉桂酸（CCA）、胶原酶、胰蛋白酶、河豚毒素（TTX）、HEPES、氢氧化铯，湖南化工研究院的色谱纯乙腈购，其他试剂是国产分析纯试剂.

1.1.3 仪器：Waters Alliance 2695高效液相色谱仪为美国Waters公司产品，MALDI-TOF-TOF质谱仪为德国Bruker公司产品，EPC-10膜片钳仪为德国HEKA公司产品，491型蛋白质测序仪为美国Applied Biosystem公司产品，真空冷冻干燥机为宁波新芝公司产品，高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品.

1.2 方法

1.2.1 JFTX-22的色谱分离和质谱分析

将粗毒配制至浓度为10 mg/mL，4℃，8 000 rpm离心20 min后用0.22 μm过滤.配制好的毒液在Waters Alliance 2695高效液相色谱仪上进行分离纯化，上样体积为100 μL.色谱柱为反相C18柱（phenomenex 100 A°，4.6 mm×250 mm，5 μm）.洗脱液A：水溶液（含0.1%TFA），B液：乙腈溶液（含0.1%TFA）.洗脱梯度：0 min—50 min，0%—50%洗脱B液，流速为1.0 mL/min，柱温35℃，在215 nm下收集洗脱峰.将CCA基质用50%乙腈溶液溶解至10 mg/ml，将1.0 μL CCA基质液和0.5 μL样品溶液混合，取0.5 μL混合液点样，室温下干燥后进行质谱分析.

1.2.2 大鼠DRG细胞的急性分离培养

参照文献[8]的方法进行大鼠DRG细胞急性分离培养.

1.2.3 JFTX-22电压门控钠电流的全细胞膜片钳记录

参考文献[9]的方法进行JFTX-22电压门控钠电流的全细胞膜片钳记录.

1.2.4 JFTX-22的氨基酸序列测定

氨基酸序列测定是利用Edman降解原理，在美国Applied Biosystem公司的491型蛋白质测序仪上进行.先将JFTX-22进行碘乙酰胺烷基化修饰，将修饰后的JFTX-22作为测序样品进行测序.

1.2.5 JFTX-22的生物信息学分析

采用电脑在线ORF程序（http：//www.ncb.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）获取开放阅读框序列，用电脑在线Expasy服务器上的ProtParam程序分析蛋白的基本理化性质（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html）.利用电脑软件SignalP 5.0预测蛋白信号肽（http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalp），SOPMA软件预测蛋白二级结构（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html）.

2 结果与分析

2.1 JFTX-22的色谱分离和膜片钳活性鉴定

将配制好的家福捕鸟蛛毒液按照上述方法进行RP-HPLC分离.其毒液RP-HPLC色谱图如图1.从图中可知，家福捕鸟蛛毒液的成分复杂，可以检测到40多个色谱峰.经全细胞膜片钳活性检测，发现出峰时间为16.32 min的色谱峰对大鼠DRG细胞TTX-R钠通道电流具有明显的抑制作用.将该成分命名为JFTX-22.JFTX-22全细胞膜片钳活性分析时，先往细胞外液中加入200 nM TTX，阻断DRG细胞上的TTX-S电流.选取小的DRG细胞进行膜片钳实验.膜片钳活性测定时将膜电位控制在-80 mV，给予脉冲宽幅50 ms，以10 mV步幅去极化电压刺激引出DRG细胞TTX-R电流，再将毒素分子JFTX-22溶液加入细胞外液中，开展JFTX-22对TTX-R钠通道全细胞膜片钳活性分析.结果表明JFTX-22对DRG细胞上TTX-R通道具有抑制作用.100 nM JFTX-22大约能够抑制5.58%±0.72%（n=3）DRG细胞TTX-R电流，当JFTX-22浓度增大到1 μM时抑制电流达到47.21%±3.2%（n=3）（图2A）.

图1 JFTX-22反相高效液相色谱图

2.2 JFTX-22质谱鉴定和序列测定

JFTX-22经MALDI-TOF质谱鉴定为单一成分的毒素分子，分子量为2807.227 Da（图2B）.通过Edman降解全序列测定，发现JFTX-22是一个由28个氨基酸残基组成，包含有6个半胱氨酸的多肽，其全序列为RCLPSGKACAGVTQKIPCCGSCVRGKCS.半胱氨酸的结构模式为X1CX6CX8CC X2CX4CX1.通过在线分析软件发现JFTX-22的理论相对分子质量为2813.40 Da，与质谱鉴定的分子量相差6 Da，表明JFTX-22的分子内6个半胱氨酸形成了3对二硫键.

图2 JFTX-22对大鼠DRG细胞TTX-R钠电流的影响（A）及其质谱鉴定图谱（B）

2.3 JFTX-22的生物信息学分析

2.3.1 JFTX-22 cDNA序列分析

根据JFTX-22 Edman测定序列和EST编码的蛋白质序列比对，找到编码JFTX-22的cDNA序列.结果表明JFTX-22的全长cDNA序列包含471碱基，其中ORF长198 bp，ORF编码65个氨基酸残基.5′-端非翻译区长85bp，3′-端非翻译区长188 bp，具有polyA尾结构.信号肽检测结果表明JFTX-22序列在前体肽N端含有20个氨基酸组成的信号肽序列，切割位点位于第20位“A”和第21位“E”之间（图3）.起始密码子为“ATG”，终止密码子为“TGA”.前体肽具有典型的“QER”蛋白酶水解位点（35-37）.毒素前体肽合成后在N端信号肽引导下进入毒囊后被蛋白酶在“QER”位点水解为成熟肽储存于毒囊中.最终合成的成熟肽由28个氨基酸组成，成熟肽序列与Edman降解法测定的序列完全吻合（图4）.

图3 JFTX-22前体肽中信号肽预测

图4 JFTX-22 cDNA序列及其推导的氨基酸序列

2.3.2 JFTX-22基本理化性质分析

根据在线ProtParam程序预测JFTX-22分子式为C112H198N38O34S6，相对分子质量为2 813.40 Da，理论等电点为9.18，不稳定指数为33.35.根据文献[10]蛋白质的不稳定指数值在40以下为稳定蛋白的标准，JFTX-22分子结构稳定.JFTX-22分子氨基酸残基组成中Cys半胱氨酸含量最高，为21.4%.带正电荷的残基（Arg+Lys）数为5个，带负电荷的残基（Asp+Glu）数0个，JFTX-22多肽链分子带正电荷，这与预测的理论等电点9.18吻合.

2.3.3 JFTX-22空间结构的预测

采用在线SOPMA程序预测JFTX-22的二级结构，结果如图5.从图中可知，JFTX-22的二级结构主要以无规卷曲（randon coil）（Cc）为主，约占整个结构的50%；其次是β-转角结构（Tt）和延伸链结构（Ee），分别为28.57%和17.86%；α-螺旋（Hh）仅占3.57%.

图5 JFTX-22二级结构预测

经同源序列搜索发现，JFTX-22与数据库中一种来自新加坡狼蛛的多肽毒素（Covalitoxin-I）的序列完全一致.Covalitoxin-I的空间结构已被解析（RCSB数据库编号为1V5A_A），但相关文章并未见发表，且功能未知.考虑到JFTX-22与Covalitoxin-I的氨基酸序列完全一致，因此，可以根据Covalitoxin-I的空间结构来判断JFTX-22的空间结构特征.经Swiss-PdbViewer软件显示，发现JFTX-22的空间结构主要包含无规卷曲和三段反平行beta-折叠，分别位于Lys7-Cys9、Ser21-Val23和Gly25-Ser28肽段（图6），与二级结构预测结果基本吻合.此外，JFTX-22序列中带正电荷的氨基酸残基在结构中具有较为集中的分布特征，其中Arg1和Lys15分布于结构的一侧，而Lys7、Arg24和Lys26分布于另一侧（图6）.

图6 JFTX-22的三级结构预测

2.3.4 JFTX-22同源序列比对

将JFTX-22序列用在线程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=Blast Search&LINK_LOC=blasthome）进行序列比对，发现JFTX-22跟一种来自新加坡狼蛛的毒素多肽（Covalitoxin-I）的序列完全一致，与另外三种蜘蛛毒素JZTX-51、U1-theraphotoxin-Pf3和HWTX-X的同源性分别为68%、68%和64%.利用Clustal X2程序将JFTX-22、JZTX-51、U1-theraphotoxin-Pf3和HWTX-X进行同源性序列比对，结果如图7.从图可知，5个毒素分子中，6个Cys不但高度保守且位置完全相同，为第2、第9、第18、第19、第22和第27位.而且第4位和第17位的Pro、第6位和第20位的Gly、第16位的Ile以及第26位的Lys也完全相同.另外，第1位和第24位的Arg、第3位的Leu、第7位和第15位的Lys、第14位的Gln保守性也很高.因此，这5个毒素分子同源性很高，可能来源于共同的祖先.

图7 JFTX-22同源性序列比对

3 讨论

我们都知道，表达于DRG细胞上的TTX-R钠电流主要有Nav1.8和Nav1.9两种类型，其中以Nav1.8电流为主.Nav1.8和Nav1.9电流也是目前国内外研究的热点.大量研究结果表明Nav1.8在神经病理性、多种伤害性刺激诱发的疼痛以及机体炎症中起着重要的作用[11]，而Nav1.9与疼痛调节和炎症反应紧密相关[12].由于JFTX-22对DRG细胞TTX-R钠通道电流具有明显的抑制作用，因此，JFTX-22是一个潜在的具有镇痛活性的毒素分子.

下一步以JFTX-22与TTX-R通道为研究对象，在如下三方面开展深入研究.（1）JFTX-22与TTX-R通道相互作用的模式（JFTX-22与TTX-R通道电压-电导关系的影响；JFTX-22与TTX-R通道浓度依赖性）.（2）JFTX-22与TTX-R通道相互作用的分子机制（JFTX-22活性关键位点的鉴定；JFTX-22作用于TTX-R通道突变体相互作用的分析）.（3）在前面两方面实验的基础上确认JFTX-22具有潜在的镇痛活性等，通过建立大鼠镇痛模型，验证JFTX-22对镇痛治疗的效果及其潜在机制.