崔芳 彭立嗣 金震东

海军军医大学第一附属医院消化内科，上海市胰腺疾病研究所，上海 200433

胰腺癌是恶性程度极高的消化系统肿瘤之一，虽然近年来预后稍有改善，但5年生存率仍不足9%[1]。胰腺癌早期诊断困难，大多数诊断明确时已属中晚期。胰腺癌的具体发病机制目前仍不清楚，从基因层面研究有助于进一步了解其瘤内异质性及恶性进展，从而对胰腺癌的早期诊断、分期及寻找新的药物治疗靶点提供理论基础。单细胞测序技术可以检测到单个细胞的基因变化，便于进一步加深对胰腺癌组织内不同细胞异质性的认识。

一、单细胞测序技术的研究进展

2009年Tang等[2]首次报道了基于高通量测序的单细胞转录组测序方法，近10多年来相关技术得到飞速发展。2011年Navin等[3]开发了单细胞基因组测序技术，2013年汤富酬课题组[4]实现了单细胞全基因组甲基化测序。2015年Drop-seq[5]和inDrop技术[6]相继推出，通过微流控技术结合升级液滴和条形微珠，微珠直接捕获mRNA，极大提高了测序细胞通量，降低了成本。2017年Zheng等[7]提出10×GemCode技术，该技术将条码反应液滴以油滴封装，反转录效率更高，且样本量可提高至10万个。目前常用的10×Genomics Chromium系统便是基于该技术。

在单细胞转录组测序方面，近年来又涌现出数种单细胞RNA-seq的cDNA扩增方法，包括PCR扩增(Tang/Brady[2,8]方法、Smart-seq[9]、Smart-seq2[10]、STRT-seq[11]和SMA[12])、体外转录扩增(qCell expression by linear amplification and sequencing，CEL-seq)[13]和Phi29聚合酶扩增(Phi29-mRNA amplification，PMA)[14]3类。以Smart-seq为例，Smart-seq技术设计了两个特殊引物，引物1用于定位至mRNA的3′端，保证了逆转录酶的起始位置，结合MMLV(moloney murine leukemia virus)逆转录酶，可以在新合成的cDNA的3′末端多出几个C碱基，引物2可以与其发生杂交，引导MMLV酶以cDNA第一链为模板发挥DNA聚合酶作用，从而获得全长双链cDNA。……