崔芳 彭立嗣 金震东

海军军医大学第一附属医院消化内科，上海市胰腺疾病研究所，上海 200433

胰腺癌是恶性程度极高的消化系统肿瘤之一，虽然近年来预后稍有改善，但5年生存率仍不足9%[1]。胰腺癌早期诊断困难，大多数诊断明确时已属中晚期。胰腺癌的具体发病机制目前仍不清楚，从基因层面研究有助于进一步了解其瘤内异质性及恶性进展，从而对胰腺癌的早期诊断、分期及寻找新的药物治疗靶点提供理论基础。单细胞测序技术可以检测到单个细胞的基因变化，便于进一步加深对胰腺癌组织内不同细胞异质性的认识。

一、单细胞测序技术的研究进展

2009年Tang等[2]首次报道了基于高通量测序的单细胞转录组测序方法，近10多年来相关技术得到飞速发展。2011年Navin等[3]开发了单细胞基因组测序技术，2013年汤富酬课题组[4]实现了单细胞全基因组甲基化测序。2015年Drop-seq[5]和inDrop技术[6]相继推出，通过微流控技术结合升级液滴和条形微珠，微珠直接捕获mRNA，极大提高了测序细胞通量，降低了成本。2017年Zheng等[7]提出10×GemCode技术，该技术将条码反应液滴以油滴封装，反转录效率更高，且样本量可提高至10万个。目前常用的10×Genomics Chromium系统便是基于该技术。

在单细胞转录组测序方面，近年来又涌现出数种单细胞RNA-seq的cDNA扩增方法，包括PCR扩增(Tang/Brady[2,8]方法、Smart-seq[9]、Smart-seq2[10]、STRT-seq[11]和SMA[12])、体外转录扩增(qCell expression by linear amplification and sequencing，CEL-seq)[13]和Phi29聚合酶扩增(Phi29-mRNA amplification，PMA)[14]3类。以Smart-seq为例，Smart-seq技术设计了两个特殊引物，引物1用于定位至mRNA的3′端，保证了逆转录酶的起始位置，结合MMLV(moloney murine leukemia virus)逆转录酶，可以在新合成的cDNA的3′末端多出几个C碱基，引物2可以与其发生杂交，引导MMLV酶以cDNA第一链为模板发挥DNA聚合酶作用，从而获得全长双链cDNA。2014年该方法优化后研发出了具有更高灵敏度、准确度和覆盖度的Smart-seq2技术。目前，以STRT-seq和Smart-seq2为代表的PCR扩增方法已经成为最常用的单细胞cDNA文库扩增策略，广泛应用于商业化平台及新型技术中。

目前，单细胞基因组测序技术由于捕获效率问题落后于转录组学[14]。单细胞全基因组扩增主要包括基于PCR技术的扩增、基于MDA(multiple dilacement amplification)技术的扩增，以及将MDA与PCR技术相结合后的多次退火环状扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)技术。相比于前两种扩增技术，MALBAC可以降低扩增偏倚性，提高测序覆盖度，也可明显提高单核苷酸多态性等位基因的检出率，提高幅度为70%左右。Vitak等[15]报道了单细胞组合标记测序技术(single-cell combinatorial indexed sequencing, SCI-seq)，即多次对细胞进行条形码编码标记后再测序，该方法提高了单细胞测序的规模，不仅可用于体细胞变异核酸检测，还可用于PDAC Ⅲ 期分析，确定胰腺癌亚克隆特定的拷贝数变异。

2017年，加拿大BC癌症研究中心发明了DLP(direct library preparation)方法[16]，即用微流控设备获得单细胞并裂解，在微小体积(μl)内直接加入标签序列并打断基因组，随后通过PCR加入索引条形码和测序接头，完成单细胞文库的制备，减少基于预扩增技术的偏差。2019年Laks等[17]对DLP技术进行了改进，研发出了具有更高准备度、可以构建高质量单细胞基因组文库的DLP+技术，该技术不仅规避了扩增带来的弊端，提高了规模化，而且保留了细胞及细胞核的图像资料，同时展示了如何利用单细胞基因组测序数据鉴定克隆群体及其基因组特征和单个细胞的特征(复制状态和染色体错误分离)以及基因组核形态学特征之间的关系，为研究单细胞的基因组提供了新的工具和资源库。

随着单细胞测序技术发展，在同一个单细胞中同时检测基因组、转录组及蛋白质组，即单细胞多组学测序技术成为科学家关注焦点。2015年问世的DR-seq[18](DNA-mRNA sequencing)和G&t-seq[19](genomeand transcriptome sequencing)实现了对同一单细胞的转录组和基因组平行测序，DR-seq采取先逆转录、预扩增，再将产物一分为二的策略；G&t-seq则是利用生物素化的多聚T引物将mRNA率先从基因组DNA中分离。两种组学信息的整合不仅能揭示基因组变异对基因表达水平的影响，还可对细胞基因组谱系树作进一步的转录组注释。2016年scTrio-seq(single-cell triple omics sequencing technique)技术[20]实现了同时分析单个细胞的基因组拷贝数变异(copy number variation, CVN)、DNA甲基化组和转录组学分析，基于基因组CVN信息可以检测癌细胞亚群，基于三元组学信息推断亚群的恶性程度和转移潜能，适于研究细胞群体在发育和癌症中的异质性。随着单细胞测序技术的不断更新和发展，其应用将会在解析细胞异质性、揭示微环境中细胞群体间的关系、追踪疾病发生发展等研究中发挥更加重要的作用。

二、单细胞测序技术在胰腺癌异质性研究中的应用

在胰腺癌的临床实践中，大量分型、分级和分期相同的胰腺癌患者治疗效果和预后显著不同，这表明不同胰腺癌患者之间存在异质性。胰腺癌中PDAC占比达90%，为阐明PDAC之间的分子异质性，Zhao等[21]收集了1 200例PDAC患者整个转录组数据，通过回顾性Meta分析，将PDAC划分为6种分子亚型，每种亚型都具有其特征的基因表达谱，表现出不同临床特点，进而更好地分层PDAC患者，提供个性化治疗。

此外，同一个体胰腺癌的癌细胞、肿瘤相关细胞之间也存在异质性。Peng等[22]对24例原发性PDAC和11例正常胰腺对照进行单细胞转录组测序，绘制了PDAC的单细胞转录组图谱，对胰腺癌导管上皮细胞分型，发现高表达癌细胞恶性行为相关的亚群的增殖，往往伴随着活化性T细胞的缺失，预示着较差预后。通过PDAC进展的拟时序分析， 观察到2 299个基因存在动态变化，ERBB和Notch信号等通路中发生的多个关键调节因子和转录因子被激活并参与到PDAC的肿瘤形成过程，为揭示PDAC的瘤内异质性机制及疾病进展提供宝贵资源。

胰腺癌重要病理特征为间质纤维组织显著增生，即大量肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)浸润。Ligorio等[23]通过使用单细胞RNA测序技术和RNA原位杂交技术，对不同比例CAFs与PDAC细胞混合培养后得到的92个PDAC细胞进行测序，发现大量CAFs浸润诱导PDAC细胞发生上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)或者增殖特性(proliferative, PRO)转变，从而具有更强的侵袭能力。对195个PDAC患者原位肿瘤组织的肿瘤芯片行ki67(标记EMT)和FN1(标记PRO)的RNA原位杂交(in situ hybridization, ISH)，分析了319 626个单细胞，将肿瘤腺体内含有的不同单细胞的种类和数量分为8类，其中高PRO以及高PRO和EMT细胞类型的患者生存期较短，从而清晰阐述了胰腺癌肿瘤内部结构，为揭示和研究胰腺癌异质性提供证据。

胰腺癌在不同患者、同一个患者不同癌细胞之间存在明显的异质性。单细胞测序技术可以揭示组织内不同细胞，同一细胞不同阶段的异质性。然而，由于PDAC的浸润特性，间质占肿瘤肿块的70%以上[24]，常嵌入正常胰腺组织，癌细胞占比小，且存在被蛋白酶降解的可能，胰腺癌样本对单细胞测序提出了挑战。随着单细胞测序技术的发展，可解决特殊小样本的研究、异质性亚群的分析、基因的功能富集、查找特异性标志基因，为胰腺癌发生、发展机制的深入研究提供有力技术支持。

三、单细胞测序技术在胰腺癌侵袭机制研究中的应用

胰腺癌的早期诊断困难，针对胰腺癌前病变进行单细胞测序研究，可以识别早期胰腺癌病变的潜在标志物。安德森癌症中心分别选取来自2个低级别导管内乳头状黏液性肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN)(LGD-IPMN)、2个高级别IPMN(HGD-IPMN)和2个PDAC(均通过手术切除)的5 403个细胞进行单细胞RNA测序，揭示了从非侵袭性IPMN发展为侵袭性癌症的过程中，上皮及肿瘤微环境发生的异质性改变。研究表明，即使在低级别的IPMNs中，也存在罕见细胞亚群具有侵袭性肿瘤转录特征的[25]。这种低频细胞在LGD-IPMN中的表达谱可能在RNA测序过程中被忽略，进一步说明了单细胞测序方法在阐明胰腺癌前体的上皮细胞及微环境异质性是肿瘤进展早期事件中的优越性。

胰腺癌的高转移特征是导致其预后差的重要原因[26]，约80%的胰腺癌患者伴有肝转移，胰腺癌转移相关基因表达也存在明显的异质性。Law等[27]对56例胰腺癌肝转移患者组织标本进行蛋白组学分析，根据其特点将胰腺癌分为4种亚型：代谢型、祖细胞类似型、增殖型和炎症型。其中代谢型和祖细胞类似型患者采用FOLFIRINOX化疗方案预后明显好于吉西他滨化疗组，而在增殖型和炎症型患者中并无明显差异，这一结果为确立胰腺癌肝转移患者精准治疗策略奠定基础。基于单细胞蛋白组学水平的研究，可以对胰腺癌细胞转录后进行研究，检测表达稀有的蛋白组和转录物水平，进一步映射胰腺癌中不同细胞亚群的类型和功能，对胰腺癌发生发展有更深层的认识。

在基因组和转录组水平上，加拿大安省癌症研究所[28]从314例Ⅳ期胰腺癌患者取样，使用激光捕捉纤维切割技术纯化肿瘤样本，得到330份全基因组测序数据和248份全转录组测序数据，获得分子证据，将胰腺癌重新定义为基底样A型、基底样B型、混合型、典型性A型和典型性B型5类。典型性A型和B型肿瘤通常发生在胰腺癌早期；基底样A型肿瘤表现出化疗抗性和更高的致死率，在胰腺癌晚期的占比更高；基底样B型和混合型通常表现为可切除的原位肿瘤。此外，该研究通过单细胞转录组测序发现同一个肿瘤中基底样和典型胰腺癌细胞共同存在，两者比例呈负相关；EMT过程与基底样信号的表达呈正相关。提示基底样信号与胰腺癌细胞转移和浸润的能力有关，证明新的分类的临床意义，为评估胰腺癌预后奠定基础。

四、单细胞测序技术在胰腺癌化疗耐药研究中的应用

化疗是胰腺癌治疗的主要手段之一，然而，耐药是限制胰腺癌化疗有效性的重要因素。CAFs在PDAC进展及化疗耐药性中发挥重要作用。CAFs在PDAC中形成一层很厚的结缔组织，阻碍了化疗药物进入肿瘤。澳大利亚Garvan医学研究所和Kinghorn癌症中心的研究人员发现[29]，癌细胞可以分泌基底膜蛋白多糖，它是正常基质的重要成分，在基底膜蛋白多糖的作用下，CAFs形成了既能保护癌细胞，又能协助癌细胞转移的环境。此外，降低基底膜蛋白多糖可以显著提高胰腺癌组织对化疗的反应性。Elyada等[30]采用单细胞RNA测序技术对人体和小鼠胰腺癌组织中肿瘤微环境成分进行分析，证实肌纤维母细胞CAFs和炎性CAFs的存在，并定义了其独特的基因特征。同时描述了一群表达MHCⅡ分子和CD74但不表达经典共刺激分子的CAFs新群体，它们能以抗原特异性方式激活CD4+T细胞，从而发挥免疫调节作用。这一研究为认识PDAC中CAFs的异质性，并开发专门针对肿瘤间质中CAFs的靶向疗法提供了新的理论基础。

总之，单细胞测序技术发展迅速，但其在胰腺癌方面的应用仍处于起步阶段，许多问题需要继续探索。例如如何应用单细胞RNA测序评价胰腺癌一线化疗药物的治疗效果，如何利用胰腺癌循环肿瘤细胞行单细胞测序从而实现早期诊断、筛选敏感药物并预测预后等。相信随着单细胞测序技术的不断研发和改善，上述问题可获得进一步研究和探索。

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