侯卫 汪宗清 陈晨 汤小虎

摘要：目的 探討甘草附子汤治疗强直性脊柱炎（AS）的作用机制。方法 利用TCMSP数据库挖掘甘草附子汤中的甘草、附子、桂枝、白术的化学成分、作用靶点，运用Uniprot数据库将其其标准化，通过GeneCards数据库获得AS相关基因，并绘制甘草附子汤活性成分-作用靶点-疾病网络，在蛋白互作数据库数据库中构建靶蛋白网络图并选取核心靶点，对此进行基因本体（GO）功能和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果 甘草附子汤治疗AS的关键成分有槲皮素、山柰酚、柚皮素等，关键靶点为肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、丝裂原活化蛋白激酶3、前列腺素内过氧化物合酶2等，GO功能富集分析示生物学过程1387条，分子功能80条，细胞组成29条，KEGG通路富集分析涉及IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等排名较前。结论 甘草附子汤通过多成分、多靶点和多途径治疗AS，发挥抑制炎症反应、镇痛、免疫调节等作用，为进一步机制研究提供一定的方向及参考。

关键词：网络药理学;甘草附子汤;强直性脊柱炎;免疫调节;炎症反应

中图分类号：R684.3 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）11-0049-07

Study on the Mechanism of Licorice and Monkshood Decoction in the Treatmentof Ankylosing Spondylitis Based on Network Pharmacology

HOU Wei1， WANG Zong-qing1， CHEN Chen1， TANG Xiaohu1，2

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;2. The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： To explore the mechanism of Licorice and Monkshood Decoction in the treatment of ankylosing spondylitis （AS） patients. Methods： TCMSP database was used to excavate the chemical constituents and targets of liquorice， monkshood， cassia twig and atractylodes in Licorice and Monkshood Decoction and Uniprot database used to standardize them. And then AS-related genes were obtained from GeneCards database and the map of the active ingredients of Licorice and Monkshood Decoction-effect Targets-disease network was drawn to construct the target protein network diagram in the protein interaction database and select the core targets and make gene ontology （GO） function and genome encyclopedia （KEGG） access enrichment analysis. Results： The key components of Licorice and Monkshood Decoction in the treatment of AS patients were quercetin， kaempferol， naringenin， and etc. The key targets were tumor necrosis factor， vascular endothelial growth factor， mitogen-activated protein kinase 3， prostaglandin endoperoxidation biosynthase 2， and etc.. The GO function enrichment analysis showed 1387 biological processes， 80 molecular functions， and 29 cell composition. The KEGG access enrichment analysis involved IL-17 signaling pathway， AGE-RAGE signaling pathway and tumor necrosis factor signaling pathway. Conclusion： Licorice and Monkshood Decoction can treat AS patients through multiple components， multiple targets and multiple pathways， and play role in the anti-inflammation response， analgesia and immune regulation， which provides certain directions and references for further mechanism research.

【Key words】Internet pharmacology; Licorice and Monkshood Decoction; Ankylosing Spondylitis; Immune Regulation; Inflammatory Response

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种全身性免疫性疾病。本病多从骶髂关节起病，主要涉累及中轴关节，中晚期可延及其它关节，严重者可致脊柱强直和功能丧失[1]。其病因处于研究探索中，研究发现，感染、环境、遗传、免疫等因素可能为致病因素[2]。目前尚缺乏病因治疗药物，临床主要采用非甾体抗炎药、免疫抑制剂及生物制剂等，长期使用易产生的毒副作用，以至于患者依从性差[3]。生物制剂虽然效果较好，但长期应用经济负担较重，使其选择仍较为受限。中医学将强直性脊柱炎归属为“痹证、大偻”等范畴，认为其本在肾阳虚衰、肝肾不足，风寒湿热、瘀血痰濁为标，病性多为虚实夹杂[4]。

甘草附子汤源自张仲景《伤寒论》，“风湿相搏，掣痛不得伸，近之则痛剧……甘草附子汤主之 。”由甘草、白术、附子、桂枝4味中药组成，凡属风寒湿邪互结于肢体之证，疗效颇佳。甘草附子汤在强直性脊柱炎治疗中临床中效果良好[5-6]，具体机制尚未完全明确。邓伟[7]研究发现甘草附子汤能防止破骨细胞形成，降低降低RANKL/OPG mRNA比值和M-CSF mRNA水平，减少骨侵蚀和骨破坏;高彩霞等[8]研究表明选用甘草附子汤方治疗AS活动期，有助有改善炎症指标及疼痛症状，且安全性更佳。本文运用网络药理学的方面探讨甘草附子汤治疗AS的作用机制。

1 资料与方法

1.1 甘草附子汤的化学成分 在TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分别检索甘草附子汤中甘草、附子、白术、桂枝所有化学成分，检索条件“口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18”，得到有效成分与作用靶点，并对靶点以Uniport数据库（https：//www.uniprot.org）进行标准化，得到蛋白质ID。

1.2 AS相关靶点的获取及与甘草附子汤靶点的映射 以“ankylosing spondylitis”为检索词，利用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）获取AS的靶点，将甘草附子汤靶基因与AS相关基因取交集，得到共同靶基因。

1.3 活性成分-靶点网络构建 将甘草附子汤的活性成分、共同靶基因数据输入Cytoscape 软件，构建甘草附子汤-化学成分-靶点-强直性脊柱炎的网络图，依据活性成分Dergee值筛选核心成分。

1.4 蛋白互相作用网络的构建与核心靶点的分析 将共同靶基因录入STRING数据库，以“Homo Sapience”为物种，绘制蛋白互作PPI网络图和导出TSV文件，并且运用R软件绘制条形图。

1.5 基因本体（GO）功能与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 关键靶基因GO富集分析可得到生物过程、分子功能和细胞组分3部分;KEGG通路富集分析，得到甘草附子汤作用于AS的主要通路，并对数据进行可视化。

2 结果

2.1 甘草附子汤活性化合物及潜在靶点 通过筛选条件，基于TCMSP数据库共检索得到共127个活性成分。运用Uniprot数据库对活性成分靶点进行标准化，共得到213个化合物相关潜在靶点。

2.2 强直性脊柱炎相关基因 共得到AS相关基因共2124个，人类白细胞抗原组织相容复合物B（HLA-B）、肿瘤坏死因子（TNF）、内质网氨基肽酶 1（ERAP1）、C反应蛋白（CRP）、白细胞介素23受体（IL23R）评分较高，共有71个交集基因。

将96个活性成分及71个共有靶点导入Cytoscape软件中，构建中药-化合物-靶点网络图，见图1，图中紫色为疾病，绿色为中药，蓝色为化合物，黄色为靶点，并对该网络中的活性成分所对应的靶点数目进行分析，数值越大表示在治疗AS的过程中所发挥的作用也越大，可得到槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）、甘草查尔酮A（licochalcone a）评分为前5，分别为50、17、15、14、13个关键靶点连接，其中对AS具有重要的意义，见表1（度值>10）。

2.4 核心靶点互作图 运用STRING数据库，构建71个共同靶基因的蛋白互作关系网络图，并简略1个游离靶点，见图2。图中有70个靶蛋白，897条靶蛋白相互作用关系，平均节点数为25.3;利用R软件绘制条形图，展degree排名前30的靶点，见图3。图中条形柱的长度代表degree的大小，由图可见肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子（VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、CXC趋化因子配体8（CXCL8）、白细胞介素-1（IL1B）、信号转录因子和转录激活因子3（STAT3）、上表皮生长因素（EGF）、原癌基因c-fos（FOS）等基因排名靠前，度值越大，意味在强直性脊柱炎的治疗中发挥的作用也越大。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析显示，共有生物学过程1387条，脂多糖应答（response to lipopolysaccharide）、对细菌来源的分子反应（response to molecule of bacterial origin）、炎症反应的调节（regulation of inflammatory response）等排名较前;分子功能80条，细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、受体配体活性（receptor ligand activity）排名较前;细胞组成29条，细胞组分中膜微区（membrane microdomain）、细胞膜膜筏（membrane raft）、膜区（membrane region）比例最大。见图4～6。

KEGG分析得出有与AS相关的144条信号通路。据富集基因数目选取排名前20的通路，IL-17 signaling pathway、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、TNF signaling pathway排名较前，主要涉及炎症反应、血管细胞凋亡与免疫调节等多个环节，图中，颜色越红代表富集程度越高，见图7。

3 讨论

强直性脊柱炎属于慢性进行性炎性疾病，需长期规律用药，尚无治愈的药物及方法。祖国医学在强直性脊柱炎诊治历史悠久，临床效果好，毒副作用较少。甘草附子汤由附子、甘草、白术、桂枝4味药物组成，甘草益气、缓解止痛，附子散寒除湿止痛，桂枝温经通络止痛，白术健脾除湿，共奏温经助阳，祛风除湿之效。现代药理研究也表明，甘草附子汤有减低炎症水平、镇痛、抗炎、调节机体免疫等作用[9]。

本研究发现甘草附子汤中槲皮素、山柰酚、柚皮素、甘草查尔酮A等是治疗AS的主要成分。槲皮素最核心作用之一是调节炎症，可以抑制炎症细抗胞因子和炎症酶，如降低IL-6、IL-1、IL-10的表达量，而进行抗炎症作用[10];山柰酚能显著抑制MAPK通路的表达，降低MDC、IP-10等炎症因子的形成，从而有效抑制炎症的产生[11]。柚皮素具有抗氧化、抗炎、免疫调节等广泛的生物活性，牛新力等[12]研发现其可阻断中枢神经系统中常规树突状细胞的趋化性和抗原呈递功能，减少脾脏T细胞分泌的L-17和IL-6，可能成为自身免疫性疾病研究新方向。现代药理学研究表明，甘草查尔酮A有抗炎、抗氧化、免疫促进等作用，能促进MAPK通路关键蛋白的磷酸化进抑制MA7A细胞增殖，抗关节炎作用主要依靠促进MA7A细胞及机制肿瘤细胞的表达[13]。

通过对交集基因进行PPI互作分析发现，TNF、VEGFA、MAPK3、PTGS2、CXCL8、IL1B、STAT3、EGF等为关键基因。TNF主要能促进AS患者TNF-α水平升高，放达免疫炎症反应，抑制促生长因子，成骨相关转录因子等的作用，减少成骨细胞分，促进破骨细胞的形成;TNF-α加快关节炎损害，主要通过促进软骨细胞分泌纤维蛋白转变为纤维蛋白原[14]。VEGFA能参与血管新生，主要通过刺激血管内皮细胞分裂增殖。有研究表明，其作为促血管形成因子，能够参与免疫调节，与AS患者的炎症指标、疾病活动等呈正相关[15]。 MAPK3为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员之一，在基因表达调控及细胞功能活动中发挥重要作用，可被细胞外的信号、物理刺激、炎性细胞因子（如IL1B和IL18）、肿瘤生长因子激活[16]。PTGS2与各种炎性毛细血管后微静脉通透性、白细胞的趋化、产生T细胞及疾病的发生、发展相关，有抗炎和抗氧化的作用[17]。CXCL8涉及淋巴细胞活化、增殖等，白细胞迁移及免疫反应过度活化，可促使机体免疫损伤[18]。

KEGG富集分析结果显示，甘草附子汤依靠IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等发挥AS的作用。白细胞介素-17（IL-17）通过IL-17信號通路在炎症反应及自身免疫性疾病的形成中发挥关键作用，可以激活NF-κB，诱发关节软骨炎症和破坏[19]。免疫球蛋白AGE与RAGE配体结合，可促使NF-κβ、细胞分子等激活，导致炎症级联反应的产生[20]。TNF-α信号通路的传递对机体内细胞的生长具有重要作用，有研究表明，AS患者病理性成骨与机体间充质干细胞（MSCs）成骨能力的增强相关，而TNF-α可以抑制AS患者体内MSCs成骨分化[21-22]。

综上所述，运用网络药理学的方法，甘草附子汤可以作用于多个靶点，介导多条通路发挥抑制炎症、镇痛、免疫调节等作用达到治疗AS的效应。但是后续应进行生物学实验及临床验证，以明确甘草附子汤治疗AS的机制。

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（收稿日期：2021-07-29）