张丽丽 任志龙 范燕琴 黄 静 程 晖 张 璐

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病常见的微血管并发症。足细胞损伤是蛋白尿形成、DN进展的主要机制。足细胞裂孔隔膜完整性的破坏、足细胞丢失、数量减少是DN蛋白尿的主要特征。

高糖诱导足细胞损伤的确切机制尚不清楚。Dai等[1]发现高糖诱导足细胞骨架紊乱。我们前期的研究提示高糖可介导足细胞损伤，包括细胞凋亡、足突融合及线粒体功能障碍[2-4]。C末端Src激酶(C-terminal Src Kinase，Csk)隶属于非受体酪氨酸激酶家族，其特征性的结构域包括SH2和SH3。多项研究证实Csk具有重要的生物学调节作用，包括细胞间黏附迁移、细胞增殖以及细胞极性[5-7]。我们已有的研究证实Csk通过调节细胞凋亡及细胞骨架重排介导血管紧张素II诱导的足细胞损伤过程[4,8]。本研究通过体内及体外实验，初步探讨Csk在高糖诱导的足细胞骨架重构中的作用。

1 材料与方法

1.1 1型糖尿病小鼠模型构建及分组

8周龄雄性C57BL/6小鼠12只(购自湖北省实验动物研究中心)，按照随机数字表法分配到糖尿病组和对照组，每组6只。采用链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导1型糖尿病小鼠模型，制模方法参照Fan等的报道[9]。分别于实验第1天和第6天糖尿病组小鼠经尾静脉分别注射STZ(HY-13753，美国MCE) 75mg/kg和150mg/kg；对照组小鼠经尾静脉注射等量生理盐水。两组小鼠于第7天开始每周测定一次尾静脉血糖(强生稳悦智佳血糖仪)至第12周。血糖水平超过16.7mmol/L的小鼠被认为成模(糖尿病组6只小鼠均成模)。之后脱臼处死两组小鼠，摘取肾脏用于后续实验。该实验程序和方案得到武汉大学人民医院动物实验伦理委员会批准。

1.2 足细胞培养及分组

永生性人足细胞株由英国Bristol大学Moin A．Saleem教授惠赠，武汉大学人民医院肾病研究所保存。常规复苏后，用含10%胎牛血清(美国Gibco, 10100147)、胰岛素铁硒传递蛋白(ITS, 美国Gibco,41400045)的RPMI 1640(美国Hyclon，SH30027)培养基于33℃、5%CO2培养箱中增殖培养7-10天，再用不含ITS的上述培养基于37℃、5%CO2培养箱中分化培养10-14天。分化成熟的足细胞分为正常葡萄糖组(NG组：5mmol/L葡萄糖,24h)、高渗组(MA组：5mmol/L葡萄糖和25mmol/L甘露醇,24h)、高糖组(HG组：30mmol/L葡萄糖,24h)及HG+Csk siRNA组(Csk siRNA转染48h+30mmol/L葡萄糖，24h)。

1.3 Csk siRNA转染足细胞

Csk siRNA及Hiperfect转染试剂均购自德国QIAGEN公司(Csk siRNA: No.102741; Hiperfect: No.301704)。转染前一天将足细胞传代并种植于6孔板中，细胞密度约 3×105个/孔。转染当天取150ng Csk siRNA与15μ l HiPerfect 转染试剂加入无血清培养基中轻柔混匀，逐滴加入6孔板培养基内，置于37℃培养箱内，6h更换一次培养基，共转染48h。

1.4 免疫荧光法检测肾脏Csk表达

新鲜肾组织经多聚甲醛固定-石蜡包埋后制成组织蜡块，采用Leica石蜡切片机切片后，二甲苯-酒精梯度脱蜡，柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)行抗原修复。10%牛血清封闭1h，抗Csk多克隆抗体(1∶50， sc-286，美国Santa Cruz) 4℃孵育过夜，驴抗兔Alexa Fluor488 (1∶100，711-545-152，美国Jacskon Immunoreseach) 37℃避光孵育1h，含DAPI抗荧光淬灭封片剂(P0131，上海碧云天)封片后共聚焦荧光显微镜(FV.500，日本Olympus)观察并摄片。

1.5 Western印迹法检测Csk蛋白表达

(1)提取总蛋白：收集各组足细胞或绿豆大小肾皮质加入RIPA细胞裂解液(P0013，上海碧云天)(丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF∶蛋白分解抑制剂cocktail∶RIPA=1∶1∶100)；(2)BCA法测定蛋白浓度，每组取等量样本；(3)电泳：10%SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜(0.45，Millipore)；(4)封闭：5% 脱脂奶粉室温封闭1h；(5)一抗孵育：一抗稀释到合适浓度(Csk，1∶500，sc-286，美国Santa Cruz; GAPDH，1∶2 000，AG019，上海碧云天)，4℃孵育过夜；(6)二抗孵育：二抗稀释后 (山羊抗兔荧光二抗1∶5 000，P/N 926-32212；山羊抗鼠荧光二抗1∶5 000，P/N 926-32210，美国LI-COR)室温避光孵育1h；(7)显像及分析：红外成像系统(美国LI-COR Odyssey)显影后应用Gel-ProAnalyzer 4.5软件进行积分吸光度(A)分析。

1.6 实时荧光定量PCR检测Csk mRNA含量

收集各组足细胞或适量肾皮质以Trizol试剂法(15595，美国Invitrogen)提取总RNA，测定RNA浓度，取1μg RNA根据试剂盒 (RR037，TaKaRa，日本)说明书逆转录合成cDNA，以稀释10倍的cDNA为模板进行实时定量PCR反应。应用IDT设计引物序列(网址：https://sg.idtdna.com/pages)，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。Csk上游引物序列为：5’-CTC CAC TAA GTC TGA CGT GTG-3’，下游引物序列为5’-CAT CTT GTA GCC CTT CTC CAC-3’；内参GAPDH上游引物序列为5’-ACA TCG CTC AGA CAC CAT G-3’，下游引物序列为5’-TGT AGT TGA GGT CAA TGA AGG G-3’。以2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.7 足细胞F-actin细胞骨架免疫荧光染色

细胞传代后于6孔板中种植细胞爬片，不同分组刺激结束后弃去培养基，用预冷的4℃ PBS缓慢摇洗3次，每次5min，4℃预冷的4%多聚甲醛固定1h，取FITC-phalloidin(5mg/L，P5285，美国Sigma)室温避光孵育30min，常温PBS缓慢摇洗3次，每次5min，用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂(P0131，上海碧云天)封片，共聚焦荧光显微镜(FV-500，日本Olympus)观察并摄片。采用F-actin肌动蛋白重组评分(CFS)评价骨架重排：正常应力纤维，计0分；F-actin形成外周环，外周环范围小于1/2胞膜边缘，计1分；F-actin形成的外周环超过1/2胞膜边缘，计2分；F-actin形成完整外周环，计3分。每组计数100个细胞，取平均值作为CFS评分。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 肾小球Csk表达及分布

免疫荧光结果显示，糖尿病组和对照组小鼠肾小球内均有Csk表达，主要沿毛细血管袢分布；糖尿病组Csk表达明显多于对照组，见图1。Western印迹结果显示，与对照组比较，糖尿病组肾小球Csk蛋白表达水平明显增加 (0.198±0.029 vs 0.441±0.042，t=8.381，P<0.01)；实时荧光定量PCR结果显示，与对照组比较，糖尿病组肾小球Csk mRNA表达水平较对照组显著上调，相对表达量为4.175±0.526 vs 1.000±0.001(t=10.45，P<0.01)。见图2。

图1 两组小鼠肾小球内Csk的表达及分布(免疫荧光法，× 400)

注：A为对照组和糖尿病组肾小球Csk蛋白电泳图；B、C分别为对照组和糖尿病组肾小球Csk蛋白、mRNA水平直方图;与对照组比较,*P<0.01图2 两组小鼠肾小球Csk蛋白及mRNA表达水平比较(n均=6)

2.2 足细胞Csk蛋白和mRNA表达水平比较

Western印迹结果显示，MA组与NG组比较，Csk蛋白水平无明显差异(0.1361±0.0093 vs 0.1326±0.0098，t=0.513，P>0.05)，HG组 (0.3104±0.0176)明显增加(t=15.160，P<0.01)，HG+Csk siRNA组(0.1647±0.0105)则较HG组显著降低(t=12.270，P<0.01)，见图3。实时荧光定量PCR与之趋势相同，HG组足细胞Csk mRNA表达水平高于NG组(5.3973±0.3916 vs 1.0031±0.0012，t=19.440，P<0.01)，HG+Csk siRNA组Csk mRNA表达水平(2.2913±0.3817)较HG组显著降低 (t=9.838，P<0.05)。见图4。

2.3 Csk siRNA转染对足细胞F-actin分布及其评分比较

NG组和MA组足细胞F-actin沿足细胞呈极性分布，高度有序平行聚集成束贯穿于细胞全长，F-actin评分分别为0.4901±0.1212 和0.4263±0.1291，差异无统计学意义(t=0.624，P>0.05)；HG组足细胞F-actin发生重构，排列紊乱，沿细胞膜外周分布，形成外周环，足细胞失去原有的细胞张力，细胞体回缩。F-actin肌动蛋白评分 (2.4350±0.2391)高于NG组(t=12.570，P<0.01)；HG+Csk siRNA组足细胞骨架重构改善，未见明显F-actin外周环形成，F-actin评分(1.4854±0.3217)低于HG组，差异有统计学意义(t=4.103，P<0.05)。见图5。

注：与NG组比较，*P<0.01；与HG组比较，#P<0.01图3 各组足细胞Csk蛋白表达水平比较(n均=3)

注：与NG组比较，*P<0.01；与HG组比较，#P<0.05图4 各组足细胞Csk mRNA表达水平比较(n均=3)

3 讨 论

足细胞是终末分化、高度特异性的肾脏固有细胞，是肾小球滤过屏障的重要组成部分[10]。足细胞的形态和功能主要依赖于肌动蛋白细胞骨架系统，后者通过细胞骨架蛋白、肌动蛋白结合蛋白和足突顶区多糖蛋白的共同作用，维持裂孔隔膜的完整性[11]。足细胞足突融合、线粒体功能障碍、细胞凋亡等一系列形态和功能的损害是导致DN发生发展的重要因素之一[12, 13]。因此了解高糖诱导足细胞损伤的分子机制和作用靶点将有助于制定DN的治疗策略。本研究通过体内体外实验发现，糖尿病小鼠肾小球和体外高糖诱导足细胞，其Csk表达均增高，而体外转染siRNA可下调足细胞Csk表达，减轻高糖诱导的足细胞骨架重排和F-actin评分，提示Csk参与高糖诱导的足细胞损伤。

注：与NG组比较，*P<0.01；与HG组比较，#P<0.05图5 各组足细胞F-actin分布及评分(免疫荧光法，×400，n均=3)

Csk是一种高度保守的非受体蛋白酪氨酸激酶，分子量为50 kDa。Csk的一级结构可以分为5个结构域：C端、酪氨酸激酶结构域、Src同源3 (SH3) 、SH2结构域、N端结构域[14]。其核心结构是位于氨基端的 SH2 和 SH3 串联结构域，以及具有底物特异性结合的酪氨酸激酶结构域，可与多种底物蛋白相互作用以发挥Csk的调节作用；Csk缺乏跨膜结构域和N端脂肪酸酰基修饰结构域，因此主要存在于细胞质中。研究发现，Csk通过SH3-SH2结构域可有效地与位于富含胆固醇细胞膜上的支架/适配蛋白(Cbp/PAG, Paxillin, JAM-A, Caveolin-1)等结合[7, 15-17]，其细胞定位从胞浆向胞膜转移，通过磷酸化SRC-家族蛋白酪氨酸激酶(SRC-family Protein Tyrosine Kinase, SFK)的酪氨酸Tyr529位点负性调节SFKs的磷酸化和激酶活性，导致SFKs从胞膜脂筏转移。Csk的独特结构和功能使其参与细胞凋亡、骨架重排、细胞周期进程、分化和发育等生物学过程。本课题组前期研究发现血管紧张素II可诱导足细胞Csk表达增加，Csk通过调节负性调节SFKs家族的Fyn激酶的磷酸化改变nephrin蛋白的表达及磷酸化参与足细胞凋亡以及血管紧张素II介导的细胞骨架重排[4, 8]。本研究在前期基础上，进一步发现Csk作为重要的调控分子，还参与高糖介导的足细胞骨架重排。

目前，Csk调控足细胞肌动蛋白骨架重构的具体分子机制仍不清楚。基因敲除Csk，可诱导胚胎成纤维细胞异三聚体G蛋白和G蛋白偶联受体功能异常，完全阻断肌动蛋白应激纤维的形成，而在Csk缺失的细胞中转染Csk表达载体，可重新恢复肌动蛋白应力纤维的形成[18]。研究发现Csk与磷酸化的Paxillin相互作用，与神经细胞突触结构的稳定性和信号转导密切相关。而Paxillin主要存在于局部黏附区，参与连接肌动蛋白细胞骨架的微丝和微管结构[14]。这提示Csk对细胞骨架应力纤维系统稳定性的维系有着不可或缺的作用。Maldonado等[19]发现整合素αvβ3 可以增强Csk的胞膜定位，后者通过磷酸化Src，负性调控Src的活性，进而活化Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated Coiledcoil Containing Protein, ROCK)促进丝切蛋白(Cofilin)磷酸化，导致肌动蛋白细胞骨架重构和神经元轴突收缩。而本课题组前期研究已证实，Csk-SFKs通路参与了足细胞的病理损伤过程，因此推测Csk亦可能通过调节下游SFKs激酶活性参与高糖诱导的足细胞肌动蛋白细胞骨架系统的稳定性，其相关研究有待进一步开展。

综上所述，本研究证实高糖刺激可直接诱导足细胞细胞骨架重排，并推测Csk可能参与高糖诱导的足细胞骨架重排，其具体分子调控机制和对足细胞的生物学作用仍有待进一步探讨。

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