季权安，刘 燕，肖琛闻，黄叶娥，李 科，韦 强，鲍国连

(浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021)

兔流行性腹胀病是由特定病原引起的以腹胀为典型临床特征的家兔传染病[1]，自2004年春开始在我国各地流行，具有高发病率和高死亡率[2]。关于兔流行性腹胀病的病因，目前尚无定论，生产上也还没有较为有效的治疗措施[3]。为了早日探明病因，作者团队先后在浙江省台州临海(LH)、嘉兴嘉善(JS)、杭州富阳(FY)等地的30多家规模兔场开展流行病学调查，从上百例被检病死兔病样中分离病原菌，其中，居首位的是大肠埃希菌(Escherichiacoli)，排其次的是魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)。另外，团队人员还从病死兔的粪便和肠黏膜样品中镜检到少量球虫卵囊。据此，我们认为该病可能是一种以魏氏梭菌为主，单一或混合大肠埃希菌、沙门氏菌感染所致的传染病[4]。大肠埃希菌和魏氏梭菌容易产生耐药性，用化学药物进行控制，不但成本高、效果差异大，还易造成药物残留。当前，我国正在实行饲料端全面禁抗(生素)、养殖端减抗限抗，因此对新型、绿色抗生素替代品的探寻已迫在眉睫。溶菌酶(LZ)具有杀菌免疫功能[5]，于1921年由苏格兰生物学家亚历山大·弗莱明发现[6]，是动物上重要的非特异性免疫因子。革兰氏阳性菌(G+)的细胞壁和革兰氏阴性菌(G-)的内壁层几乎全部由肽聚糖组成，LZ能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，使细胞溶解死亡[7]，从而达到抗菌消炎的目的。LZ与抗生素的杀菌机制不同，不易产生耐药性，具有安全、无残留、活性稳定等优良特性[8]。为了有效防治兔流行性腹胀病，根据流行病学调查与病原分离鉴定结果，本研究选取LH、JS、FY的3家兔流行性腹胀病常发场，开展LZ临床防治试验研究。现将相关内容总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

供试小白鼠40只，体重在30～50 g，购自浙江省中医药大学。供试幼兔56只，2月龄左右，体重在1.0～1.5 kg，由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所试验兔场提供。

另选取LH、JS、FY的3个常发病兔场的60日龄无症状兔，及经实验室确诊、症状轻重不一的流行性腹胀病患兔用于预防和治疗试验。

1.1.2 药品和主要试剂

LZ(酶活力≥500 U·mg-1，批号为200423)，由浙江艾杰斯生物科技有限公司提供；普通琼脂培养基、肉汤培养基、姬姆萨氏染色液由本实验室配制；血琼脂培养基、TSA培养基、伊红美兰琼脂培养基、TSB培养基、麦康凯培养基，及生化试验用各种糖发酵管、甘露醇、甲基红(MR)试剂、VP试剂、尿素酶试剂、H2S，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。其他相关化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查

深入主要养殖地区实地走访，组织浙江省台州、嘉兴、宁波、绍兴、杭州等地的养殖户主、饲养人员、诊治兽医开展座谈，询问养殖场发病现状、临床症状、防治措施与效果，以及同群和邻群、本场和当地兔场有无类似病例。入场抽查，现场观察位于LH、JS、FY的3个常发病兔场的病情，详细了解饲养、管理、环境卫生、饲料质量、水源安全等情况。借助统计学方法，对流行病学调查数据进行比较分析。

1.2.2 临床剖检与病理变化观察

将病死兔头朝左，右侧卧于解剖台上，用带钩镊子配合剪刀解开体表，露出左侧胸腹部，然后从腹部朝兔头方向剪去整个腹部肌肉，用大剪去掉前胸廓，露出整个胸腹腔，逐一查视心、肝、脾、肺、肾、气管、肠系膜淋巴结等器官、组织是否充血、出血、肿胀，有无变性、坏死灶、灰白色结节等病变，观察胃、十二指肠、空肠、结肠、盲肠内容物状况，及胃、肠黏膜有无脱落，胃是否膨大、充满气体和液体。

1.2.3 病原分离鉴定

无菌采集心、心包液、肝、脾、肾、肠系膜淋巴结、胃内容物、小肠内容物和盲肠内容物。将上述内脏病料接种于普通琼脂培养基、肉汤培养基、TSA培养基、TSB培养基、麦康凯培养基、血琼脂培养基平板，37 ℃培养24 h。挑取形态特征均一的菌落传代纯化，将纯化的培养物再次划线接种于血琼脂培养基平板，37 ℃培养24 h，观察菌落形态，并进行革兰氏染色镜检。将纯化后的病原菌按照常规方法进行生化试验，并将纯化后的病原菌接种到幼兔体内进行复壮培养，提取后供致病力试验用。

用上述肉汤培养物(即将无菌采集到的病料接种于肉汤培养基后经纯化复壮培养的菌毒，亦称复壮毒)注射小鼠(经预试验确定每只注射0.02 mL)和2月龄左右的供试兔(经预试验确定每只注射0.5 mL)，24 h后观察死亡和病变情况。

人工发病试验：取上述肠内容物(含小肠内容物和盲肠内容物)用超纯水3倍稀释，无菌纱布过滤，1 000×g离心15 min，灌喂健康幼兔4只，每只1 mL，另设对照组4只。

取病死兔病变部结节或刮屑物进行压片或涂片，用姬姆萨氏液染色，镜检各型虫体。应用饱和盐水漂浮法镜检球虫卵囊：取新鲜兔粪5～10 g放入量杯中，先加少量饱和盐水将兔粪捣烂混匀，再加饱和盐水到50 mL，将粪液用双层纱布过滤，滤液静置15～30 min，取浮液镜检球虫卵囊数量。

1.2.4 预防与治疗试验

分别在LH、JS、FY常发病兔场采用LZ进行临床防治试验。选取60日龄无症状兔开展预防试验，选取经实验室确诊、症状轻重不一的流行性腹胀病患兔进行治疗试验。每个兔场设4组，即将预防试验和治疗试验均随机分为处理组和对照组，每组45只。预防试验中，处理组每100 kg全价饲料添加10 g溶菌酶，按照1日2次、每次每只35～50 g的量(即按照兔体重7%的比例，下同)饲喂，连用5 d；治疗试验中，处理组每100 kg饲料添加20 g溶菌酶，按照1日2次、每次每只35～100 g的量饲喂，连用5 d。预防试验和对照试验中，对照组饲料中均不添加任何药物。观察、统计各组的发病、死亡和治愈只数。

防治效果的判定标准如下：腹胀消失，精神、食欲正常的判为治愈；预防过程中出现精神不振、食欲减退、腹部膨胀等现象，触摸腹部有明显的硬物感，伴有不同程度的腹泻或便秘的判为发病；防治过程中发生死亡的判为病死。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查结果

流行病学调查结果与业内学者观点基本相符：该病不分品种、不分季节均可发病，但以春、秋季高发，发病率普遍在30%～60%，病死率达90%以上，病情严重兔场病死率高达100%。发病兔以断奶至3月龄为主，尤以40～70日龄发病率最高，成年兔少发，未见哺乳期发病。发病期普遍持续1～3周，最长可达1个月以上，部分兔场间隔一段时间会复发。该病呈地方流行性，不同地区间有较大差异。

调查还发现，LH、JS的饲养管理、环境卫生相较于FY差，发病情况相对更严重。添加抗球虫药物、抗菌药物进行防治的养殖场大多反映效果不佳或不明显。

2.2 临床症状和病理变化

观察临床病症发现，多数病死兔腹部膨胀如鼓(图1)，触摸腹部有明显硬物感，肛周围被毛潮湿并伴有粪便污染。剖检病死兔可见：心、肺、胸腺等脏器有不同程度出血，但肝、脾、肾未见明显的出血点、坏死灶和灰白色结节等病变；胃肠臌气，积液，部分家兔胃黏膜脱落，溃疡；肠壁有出血点；盲肠内充满气体，伴有较硬的块状物；有的结肠、直肠有胶冻样物。

A，腹部膨胀如鼓，触摸有硬物感；B，胃黏膜脱落，溃疡；C，盲肠充满气体，内容物硬结。A， Abdominal expansion as drum; B， Gastric mucosa exfoliation and ulcer; C， Caecum filled with gas and content binding.图1 病死兔的临床病症照片Fig.1 Photos of died rabbits

2.3 细菌分离鉴定

针对LH、JS、FY送检的112例40～90日龄疑似流行性腹胀病患兔进行剖检。革兰氏染色镜检发现，部分纯化培养菌系两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌。该菌在普通琼脂培养基上生长良好，形成圆形、表面光滑、湿润、灰白色菌落，在麦康凯培养基上呈红色菌落(图2)，在伊红美兰琼脂培养基上呈黑色带金光菌落。经生化试验鉴定，该菌株能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖、木糖、甘露醇、鼠李糖，均不产生H2S，尿素酶阴性。将肉汤培养物经腹腔注射，小白鼠、家兔于24 h内死亡，且供试小白鼠全部死亡，20只供试兔中死亡19只，致死率达95.0%，病变与自然发病相同。人工发病试验结果显示：死亡2只，且从死亡家兔中分离到同种菌，另2只食欲明显下降；而对照组4只健活。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，分离菌符合大肠埃希菌生化特征。经统计，在全部112只送检患兔中，分离到大肠埃希菌的合计有78只，占比69.6%(表1)，可见，大肠埃希菌是兔流行性腹胀病的主要病原之一。

图2 大肠埃希菌革兰氏染色、分离培养(麦康凯培养基)图Fig.2 Gram staining， isolation and culture (on MacConkey agar) of Escherichia coli

在分离菌中，革兰氏染色镜检还发现部分菌端钝圆、有明显荚膜的革兰氏阳性粗大杆菌，但未见芽胞。这些分离菌在肉汤培养基上生长良好，培养基变混浊，并产生大量气体。将其接种于血琼脂平板，37 ℃厌氧培养24 h，形成双溶血环的圆形、表面光滑、边缘整齐的灰白色菌落(图3)。生化反应显示，其能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和果糖，产酸，产气，不发酵甘露醇。将肉汤培养物经腹腔注射，小白鼠、家兔于24 h死亡，且供试小白鼠全部死亡，20只供试兔中死亡19只，致死率达95.0%，病变与自然发病相同。人工发病试验结果显示：死亡2只，且从死亡家兔中均分离到同种菌，另外2只食欲不振；而对照组4只健活。该分离菌的细菌形态、培养生长特性和生化特性与魏氏梭菌一致。经统计，在全部112只送检患兔中，分离到魏氏梭菌的合计有69只，占比61.6%，与大肠埃希菌的混合感染率为55.4%，可见，混合感染魏氏梭菌是激发兔流行性腹胀病的主要病原之一。

取病死兔病变部结节与刮屑物进行压片或涂片，经姬姆萨氏液染色，镜检到少量球虫体。应用饱和盐水漂浮法，从粪便滤浮液镜检到少量球虫卵囊，属于轻微感染。此外，还有少量疑似沙门氏杆菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)等未定型杂菌。这些虫菌数量极少，并无致病力，亦未能复制到相同病例。

2.4 临床防治试验

2.4.1 预防试验

预防试验结果显示，LZ对兔流行性腹胀病具有明显的预防效果，3个兔场预防组的发病率均较对照组降低50个百分点以上(表2)，差异极显著(P<0.01)，说明LZ可作为养兔场日常预防添加使用。

表2 溶菌酶对兔流行性腹胀病的预防效果

2.4.2 治疗试验

LH、JS、FY三地兔场各取45只患兔，经过治疗，分别治愈38、40、42只，未得到有效治疗而病死的数量分别为7、5、3只(表3)。结果显示，LZ对兔流行性腹胀病具有明显疗效，是治疗兔流行性腹胀病发病的有效药物，3个兔场治疗组的病死率比对照组低70多个百分点(表3)，差异极显著(P<0.01)。

表3 溶菌酶对兔流行性腹胀病的治疗效果

3 结论与讨论

本研究对兔流行性腹胀病进行流行病学调查发现，LH、JS两地兔场多为经验不足的新建兔场，兔舍卫生条件较差，湿度较高，饲养管理不善，饲料质量也存在一些问题，从其送检病例中分离到的魏氏梭菌和大肠埃希菌相对FY的兔场要多，发病率和病死率也相对更高。王晓梅[8]调查发现，饲养管理较好的兔场很少发生兔流行性腹胀病，而卫生和管理不善的兔场，如兔舍寒冷、阴暗潮湿、阳光不足、通风不良和环境卫生差的兔场，发病较为严重。本研究经实地调查发现，饲养管理不善和不利的环境因素会明显增加兔流行性腹胀病的发病率。

大肠埃希菌、魏氏梭菌广泛存在于各地养兔场。林毅等[4]报道，兔流行性腹胀病的病原菌可能包括魏氏梭菌、巴氏杆菌、大肠埃希菌，系单一或混合感染所致。刘照波等[9]报道了在山东某兔场分离鉴定出魏氏梭菌与大肠埃希菌混合感染的兔流行性腹胀病病例；白国勇等[10]从兔流行性腹胀病病例中分离到以魏氏梭菌和大肠埃希菌为主的多株细菌，且分离菌有一定的致病力。Licois等[11]认为，该病是一种肠道细菌性传染病。Huybens 等[12]初步证明，兔流行性腹胀病由细菌感染引起，而非病毒或寄生虫感染引起。Djukovic等[13]发现，一种新型梭状芽孢杆菌的肠道定殖与小肠流行性结肠炎(ERE)的发生有关[14]。当发生ERE时，病兔消化道3个部位的厚壁菌数量减少，而胃和盲肠内魏氏梭菌数量增加[15]，且在ERE病兔肠道中分离到梭状芽胞杆菌[16]。目前，虽然尚无研究证明兔流行性腹胀病与较早发生在法国的ERE属同一种疾病，但从本研究结果看，兔流行性腹胀病同样与魏氏梭菌相关。作者团队从LH、JS、FY的上百例病死兔病料中分离到以大肠埃希菌、魏氏梭菌为主的病原菌，认为兔流行性腹胀病是以魏氏梭菌和大肠埃希菌单一或混合感染所致的一种细菌性传染病，这与学者们认为该病以细菌为主要病原的观点相吻合，但与Szalo等[15]认为其病原为不可培养的细菌的观点不尽相同。本研究中，分离到的细菌培养物和复壮毒对供试兔均具有高致死率，且从发病的供试兔上能分离到同种致病菌，病变与自然发病相同，与杨加琼[16]在小白鼠和试验兔上均能复制相同病例的结果相符。

随着行业监管力度加大，饲料已进入全程无抗化的新阶段，但这也加大了畜禽消化道细菌性疾病的防控难度。筛选、研发抗生素替代物势在必行。以往，大肠埃希菌、魏氏梭菌类细菌性疾病主要依赖抗生素防治，养殖场(户)为了防控疾病，滥用抗生素和化学药品，造成耐药菌株增多、药物残留严重等不良影响。LZ是机体非特异性免疫因子之一，既能抗菌，又能增强动物机体免疫力[17-18]，能有效降低发病率和病死率，且无毒无害，近年来受到越来越多人的关注[19]。Epaud等[5]发现，供给外源性LZ会增强动物机体对细菌的杀灭能力；Oliver等[20]研究表明，LZ与抗生素的使用效果相当；May等[21]研究发现，LZ在无抗生素的畜禽饲粮中使用，能够达到与抗生素饲粮同样的促生长效果。本研究表明，LZ用于兔流行性腹胀病治疗时具有治愈率高、恢复快的特点，无毒副作用，经口服给药不会产生应激反应。更为重要的是，LZ无残留，不会对下游的食物链产生负面影响，是一种具有完全替代抗生素潜能的绿色饲料添加剂。由于LZ具有快速高效的优点，在各地普及应用后，可最大限度地减少养殖场(户)的防控成本，使其免遭或挽回部分经济损失。在疫苗等更为先进的防治措施落地前，LZ可作为当前防治兔流行性腹胀病的首选药。