唐 琴 刘 珊 沈红梅

(云南省肿瘤医院 昆明医科大学第三附属医院 中西医结合科， 云南 昆明 650118)

据统计肺癌发病率占肿瘤总发病率的11.6%，肺癌死亡人数占肿瘤总死亡人数的18.4%[1]。大多数患者发现时已处于中晚期，部分患者已失去手术机会，另一部分患者手术后仍需化疗或靶向治疗以延长生存期和提高生活质量。尽管放化疗及靶向治疗在中晚期肺癌治疗中取得很大进展，但其5年生存率仍不理想(<15%)，肿瘤耐药性已被认为是肺癌治疗成功与否的关键因素[2]。越来越多强有力的证据支持肝癌、结肠癌、肺癌及多种肿瘤的肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)与治疗耐药性相关，有实验表明CSCs与其他肿瘤细胞相比对化疗的耐药性更强[3]。CSCs主要通过延长端粒、经历上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)及改变信号通路等方式促进肺癌耐药。本文依据国内外对肿瘤干细胞在肺癌耐药的最新研究进展，就肺癌干细胞耐药相关标志物及其作用机制作一综述。

1 CSCs概述

CSCs是存在于肿瘤中具有干细胞性质的一小部分细胞群体。干细胞具有高度自我更新能力、自我繁殖和多向分化潜能，其主要功能是控制和维持细胞再生。根据干细胞的发育阶段，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有发育全能型，可以分化为机体各种类型的细胞，成体干细胞具有自我更新能力，通常只能分化为机体特定类型的细胞。CSCs同样具有干细胞特性，可自我更新并分化为异质性肿瘤细胞，CSCs的水平与肺癌患者死亡率增高具有相关性[4]。CSCs不仅具有逃避免疫监视和抗凋亡的能力，在治疗过程中还可获得药物耐受性。虽然化疗及靶向治疗可以杀灭大量肿瘤细胞，但CSCs可以在血液中存活，随着CSCs在整个身体中传播，可以远离原发肿瘤而选择合适的肿瘤微环境继续生长[5]。CSCs是各种恶性肿瘤常规治疗失败的重要原因。因此，在治疗过程中不仅要通过手术治疗、化疗以及放疗等方式清除原发肿瘤组织及细胞，还需进一步干预CSCs介导的耐药性。

2 肿瘤干细胞相关标记物

肿瘤干细胞参与肿瘤的复发、转移及耐药等多个过程。因此，准确的检测出CSCs标志物对肿瘤后续治疗和评估预后具有指导作用。迄今为止，已经鉴定出多个存在肺CSCs细胞表面或在细胞内表达的标记物，如醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)、CD133、CD44、CD166、CD90，其中最主要的标记物包括ALDH、 CD133、CD44[6]。

2.1 ALDH

ALDH是一组在肿瘤细胞中过表达且具有排毒作用的胞质同工酶，ALDH在多种实体肿瘤中被证实其表达增加与不良预后、肿瘤干性和耐药性有关[7]。ALDH1是其家族成员之一，近年来ALDH1已被认为是多种实体肿瘤(包括肺癌、结肠癌、乳腺癌等)CSCs的重要标志物。目前临床所用的多数化疗药物(包括顺铂、环磷酰胺等)是经由ALDH1代谢。有学者发现，将少量的ALDH1阳性肺癌细胞注射入裸鼠时，它们具有启动肿瘤生长并产生异源性肿瘤的能力；然而，ALDH1阴性肺癌细胞没有显示出这种能力，这表明ALDH1阳性细胞可能具有自我更新能力，并分化出一个细胞群；此外，ALDH1阳性细胞对化疗药物具有高度耐药性，而ALDH1阴性细胞对这些药物不耐受[8]。既往研究从肺癌细胞系中分离出ALDH1阳性细胞，发现其具有体外自我更新、分化和多药耐药性等重要的CSCs特性；此外，比较了三个不同肺癌患者人群中ALDH1的表达，发现ALDH1的高表达与患者的生存率呈负相关[9]。同时，在肺癌术后患者中，ALDH1阳性患者较阴性患者5年生存率明显降低[10]。这表明ALDH不仅可以作为CSCs标志物，也可以作为预测患者预后的重要指标。

2.2 CD133

CD133抗原也被称为prominin 1，是一种120 kDa的5次跨膜蛋白，由prom1基因编码，CD133基因启动子区域的DNA异常甲基化与肿瘤中CD133的异常表达有关[11]。目前CD133被认为是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等多种实体肿瘤CSCs亚群的标记物[12]。灵芝小孢子蛋白(ganoderma microsporum, GMI)在抑制CD133的同时可以降低肺癌干性相关转录因子的表达并抑制肺癌细胞活力和球体形成能力[13]。CD133阳性细胞通过高表达ATP结合盒转运体G5(ATP-binding cassette transporter G5，ABCG5)和FADD样抑制蛋白(FADD-like inhibitor protein，FLIP)来增强对化疗和凋亡的抵抗[14]。Bertolini等[15]发现，与正常肺组织相比，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NCSLC)中的CD133阳性细胞群增加，并且在重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency mice, SCID)小鼠中具有更高的致瘤潜力，并且干性基因表达、粘附性、运动性和药物外排率比CD133阴性细胞更高。使用含铂方案治疗NCSLC患者时发现，CD133的高表达与无进展生存期较短相关[15], 表明CD133可作为NSCLC患者的预后指标。

2.3 CD44

CD44是细胞的一种跨膜糖蛋白，参与细胞生长、存活、分化和运动过程，同时，CD44和P-糖蛋白共同介导细胞多重耐药。CD44作为CSCs标记物，在调节肿瘤发生、自我更新、转移和治疗抵抗方面发挥着重要作用。有研究发现，高表达CD44亚群的肺癌细胞与CD44低表达组相比，具有更高的致瘤能力、肿瘤球形成能力和迁移特性[16]。用特定方法将腺癌模型中的A549细胞分为三阳性(EpCAM+/CD166+/CD44+)和三阴性(EpCAM-/CD166-/CD44-)亚群，发现三阳性亚群显示出更高的增殖活性、更好的克隆形成性，并且具有更强的球体形成能力，这表明其具有更好的自我更新能力；同时还可观察到在三阳性亚群中具有较高的5-氟尿嘧啶和顺铂耐药性[17]。Leung等[18]将NSCLC患者肿瘤细胞种植在裸鼠体内发现，无论是原始CD44阳性细胞还是刚分化出来的CD44阳性细胞，与CD44阴性细胞相比，都可表达OCT4/POU5F1、NANOG、SOX2等多能干基因；此外，刚筛选出来的CD44阳性细胞比CD44阴性细胞对顺铂的耐受性更强，凋亡水平更低。因此，CD44可以作为筛选CSCs的可靠标志物。

3 CSCs的耐药机制

3.1 CSCs端粒酶活性增高

端粒由重复的富G序列和大量相关蛋白组成，这些蛋白形成保护染色体末端的有效帽。端粒的长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关。端粒酶也称为端粒末端转移酶，是一种核糖核蛋白复合物，可延长端粒DNA重复序列以延长端粒。它通过延长端粒末端从而赋予细胞无限增殖的能力，在大多数肿瘤中很容易检测到端粒酶活性，但在体细胞组织中却不能，由此可见端粒酶活性对于干细胞的完整性和寿命至关重要[19]。已有多项研究表明，端粒长度的增加可赋予CSCs对多种抗肿瘤疗法的抵抗力。相反，端粒长度的缩短与药物敏感性有关[20]。肺癌干细胞显示出比非CSCs具有更长的端粒。无论是在体外还是体内，使用特定的端粒酶催化活性的小分子抑制剂2-[(E)-3-nataltalen-2-yl-but-2-enoylamino]-苯甲酸(BIBR1532)处理肿瘤干细胞，发现端粒渐进缩短，增殖能力降低以及对化学敏感性增加，对BIBR1532不敏感的细胞或从端粒酶抑制作用释放的细胞未显示出生长能力或药物敏感性的变化[21]。同样，使用端粒酶抑制剂对肺癌患者具有良好抗肿瘤效应，另外端粒酶抑制剂短期治疗对肿瘤干细胞具有逆转作用[22,23]。调节端粒酶活性是一个复杂而动态的过程，其与细胞周期调节紧密相关。因此，需进一步研究来帮助我们增进对该领域的了解。

3.2 CSCs经历EMT过程

EMT使肿瘤细胞在获得干性的同时失去极性，从而获得运动能力。在肿瘤形成过程中，EMT赋予肿瘤细胞更强的肿瘤启动、转移潜能及药物抵抗能力[24]。有研究显示，EMT发生或EMT转录因子(transcription factors，TFs)的激活赋予癌细胞干样特征[25]。Twist1是调控EMT过程的重要转录因子，增强Twist1的表达可以促进EMT、癌细胞迁移和肿瘤干细胞特征(包括多能性因子的表达，肿瘤球体形成的能力和干细胞表面标志物的表达增加)，这说明EMT和肿瘤细胞获得干性是存在联系的[26]。因此我们认为，部分CSCs可能经历EMT过程，并获得侵袭、转移及耐药的能力，这可能是引起治疗疗效不佳的主要因素。然而，Chen等[27]和Tiran等[28]在肺癌中发现，上皮表型CSCs比间质表型CSCs具有更高的肿瘤形成能力和化学抗性。这一观点的提出，对间质型CSCs引起肿瘤启动和药物治疗抵抗模型来说是一个巨大挑战，还需要进一步的研究来证实这一观点。

3.3 CSCs信号通路转导异常激活

3.3.1 Wnt/β-Catenin信号通路

Wnt主要包含3条信号通路，其中最具代表性的Wnt/β-Catenin与肿瘤的发生发展密切相关。Wnt/β-catenin是一种进化保守的信号转导途径，它主要参与细胞的增殖、存活、运动、分化和凋亡等过程。氯化白屈菜碱是一种苯并菲啶生物碱，可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路从而抑制肺癌干细胞侵袭、转移及球体形成能力[29]。伊曲康唑在体外通过抑制Wnt信号传导，改变肺癌干性特征，但不影响细胞生存力，这表明伊曲康唑可能成为抑制肺CSCs的一个靶向药物[30]。在体外激活肺癌细胞Wnt/β-Catenin途径，再用不同浓度顺铂处理A549细胞，发现细胞的耐药性均有不同程度的增强，并且CSCs相关标志物表达上调[31]。有研究发现，在高表达Oct4和Nanog且对吉非替尼耐药的两个肺癌细胞系中，β-catenin染色明显，且Wnt信号通路相关mRNA及蛋白过表达，细胞经历EMT过程，这说明激活Wnt/β-Catenin通路可使肺CSCs获得耐药性，并促进肿瘤细胞发生EMT[32]。

3.3.2 Hedgehog信号通路

Hedgehog(Hh)信号通路在人类胚胎形成的早期，器官发育过程中被生理激活，而异常激活可导致各种肿瘤的发生[33]。最早在造血系统恶性肿瘤中发现Hh途径对维持CSCs特性至关重要，随后在各种实体瘤中也得到同样结果。Hh通路被过度激活，肺成纤维细胞表达间充质干细胞标志物，并获得分化能力和免疫抑制潜能。ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白，是一种膜转运蛋白，由ATP水解供能将结构上不相关的小分子(例如环磷酰胺、顺铂等)向细胞外排出。正常干细胞和肺癌CSCs中ABC转运蛋白表达升高，化疗药物从胞内排出，从而降低药物疗效[34,35]。

Hh途径可通过上调ABC转运蛋白以及发生EMT从而使肿瘤细胞对铂类耐药，然而抑制Hh途径能够增加细胞对铂类药物的敏感性，并降低CSCs表型的表达[36,37]。在体外肺癌细胞模型中，miR-182-5p可通过下调Hh途径的转录蛋白，即神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白(glioma-associated oncogene homolog，GLI)来增加细胞对顺铂的敏感性[38]。研究表明，SHH信号通路的成分在耐吉非替尼的具有干细胞特性的PC9GT细胞中高度表达，然而抑制SHH途径可逆转PC9GT对吉非替尼的耐药性[39]。Sox2为胚胎干细胞转录因子，对维持肺腺癌CSCs的自我更新尤为重要。调节Hh通路抑制Sox2的表达，不仅可以减低肺癌CSCs的自我更新能力和细胞活力，还可以增加肺癌CSCs对顺铂和吉非替尼的敏感性[40]。

由此可见，Hh通路在肺癌干性及耐药性的维持中发挥至关重要的作用，Hh可以作为肺癌的潜在干预靶点。

3.3.3 Notch信号通路

Notch是高度保守的信号传导通路，介导细胞分化、增殖、存活和凋亡[41]。最近研究表明，miRNA在调控CSCs特性中起关键作用。Jiang等[42]发现，miR-1275可通过激活Notch信号，增强肺腺癌细胞的干性；拮抗miR-1275或抑制Notch通路可有效逆转miR-1275诱导的通路共激活和干性特征。高Nocth活性的肺腺癌细胞亚群在血清中培养或连续异代种植发现，该细胞亚群不仅可形成肿瘤球，还能产生异质细胞群；而阻断Notch信号通路则使该细胞亚群丧失上述能力；用化疗药物分别作用于高Nocth活性和低Nocth活性的肺腺癌细胞后，低Nocth活性的细胞活力降低，提示高Nocth活性的细胞具有更强的化学抗药性[43]。上述结果表明，Notch信号的异常激活可以增强肺CSCs特性，增加耐药性，导致预后不良。

4 总结及展望

化疗及靶向治疗，可与手术、放疗等治疗方式相互配合以延长肺癌患者的生命。如何增加肺癌细胞对药物敏感性，以及寻找新的治疗靶点已成为当前研究的热点。近年来多项研究表明，肺CSCs通过延长端粒、上皮间质转化、异常激活信号通路以及表达抗药性蛋白等方式在药物抵抗中发挥重要作用。目前临床上针对肺CSCs的特异性药物尚有待开发，相信随着对CSCs标志物和耐药机制不断深入了解，研发针对CSCs的药物有望成为治疗肺癌和逆转肺癌抗药性的新方向。