环境中重金属暴露对抗生素抗性基因演变影响研究进展

2021-11-24邱文婕秦艳高品

环境工程技术学报 2021年6期

邱文婕，秦艳，高品

东华大学环境科学与工程学院

抗生素是一类广谱杀菌药物，可预防细菌感染疾病，被广泛用于治疗人体疾病和促进动植物生长[1]。由于缺乏正确而科学的抗生素使用规范，大量抗生素药物及其代谢产物被排入环境中，对细菌产生选择性压力[2]，使敏感性细菌逐渐对其产生抵抗性，进而促进抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的演变和传播[3-4]。传统观点认为，细菌抗药性会随着抗生素胁迫作用的消失而消失[5-8]。然而事实并非如此，即使在不使用抗生素的情况下，ARGs仍可稳定存在。越来越多的研究发现，重金属[9-10]、杀菌剂[11]、消毒剂及其消毒副产物[12-13]、农药[14]、去污剂[15]、离子液体[16]、纳米颗粒[17]等对ARGs的环境行为同样具有显著影响。此外，微塑料和大气颗粒物等固相介质吸附携带的无机和有机污染物也会对ARGs产生重要影响[18-22]。由此可见，ARGs在环境中的存在、演变和散播是一个受多因素影响的复杂过程，近年来在全球范围内已受到广泛关注。

作为环境中常见的污染物之一，重金属具有不可生物降解性，能够在环境中稳定存在，对生物体具有持久性胁迫作用，可通过食物链传递进行富集，对人体健康产生严重危害。重金属可直接作用于微生物细胞结构，也可通过改变环境条件(如pH等)间接影响细菌，进而产生毒性效应[23-25]。重金属长期选择性作用能够激发细菌的自我防御机制，使其逐渐产生抵抗性[26]。有研究报道[27-29]，从重金属Cu污染土壤中分离出来的细菌对抗生素胁迫的抵抗性要比Cu敏感细菌更强，表明重金属可能会通过共选择作用使其对抗生素产生抵抗性。基于此，笔者针对环境中重金属对ARGs环境行为的影响过程研究现状，概述了细菌对抗生素和重金属的协同抗性机制，重点论述了重金属对ARGs丰度变化和水平转移过程的作用影响，并对未来发展趋势进行了展望。

1 细菌对抗生素和重金属的抗性机制

1.1 抗生素抗性机制

细菌对抗生素的抗性机制主要包括细胞膜渗透性改变、外排泵机制、细胞靶位点改变等(图1)。其中，生物膜的形成是细菌抵御抗生素作用的主要途径[30]，其分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)可形成天然屏障，减弱抗生素分子向细菌体内部渗透[31]。外排泵也称外排蛋白，细菌可通过外排泵机制将抗生素等对细胞有毒害作用的物质排出体外，降低其对细胞的损害[32]。细胞靶位点改变是指抗生素分子与细菌细胞相互作用的靶位酶基因发生突变，降低彼此之间的亲和力，导致抗生素作用失效[32]。

图1 细菌细胞对抗生素胁迫作用的抵抗机制Fig.1 Resistant mechanisms of bacterial cells to stresses of antibiotics

1.2 重金属抗性机制

重金属可在生物体内积累，其毒性作用可通过食物链传递并放大[33-34]。在重金属胁迫作用下，细菌可通过以下3种方式削弱其毒性影响[35-37]： 1)通过分泌的EPS与重金属发生络合作用和离子交换等过程，降低重金属的生物可利用性。EPS可为细菌提供许多重要功能，如促进细胞膜的结构发育，增强细菌黏附力，以及提供保护性屏障等[38]，生物膜对抗生素的抵抗性主要源于EPS的保护作用，提高细胞对抗生素的耐受性，EPS也可作为运输屏障抑制细胞质粒或DNA跨膜转移[39]。2)在细胞内可通过氧化还原等作用使对细胞具有显著毒性效应的重金属降低毒性。3)细胞可通过改变细胞膜的渗透性，减少重金属进入细胞，也可通过外排泵系统将重金属排出体外[40]，其外排泵机制与抗生素外排泵机制类似，通过转运蛋白将重金属离子泵出细菌细胞(图2)。

图2 细菌细胞对重金属胁迫作用的抵抗机制Fig.2 Resistant mechanisms of bacterial cells to stresses of heavy metals

1.3 抗生素与重金属共抗性机制

协同抗性机制与交叉抗性机制是细菌抵抗重金属和抗生素作用的主要共抗性机制[40]。协同抗性机制指重金属抗性基因(metal resistance genes, MGEs)和ARGs同时位于整合子、转座子、质粒等遗传元件上[41]，交叉抗性机制是细菌利用同一系统同时对重金属和抗生素产生抗性。在此条件下，细菌可对多种重金属和抗生素具有抗性[42]。

Dickinson等[43]通过分析英国西北部某池塘沉积物中重金属浓度，以及重金属抗性和抗生素抗性情况发现，细菌对Zn的耐受水平与Zn浓度呈正相关，而耐Zn菌株占比与奥沙西林、头孢噻肟和甲氧苄啶抗生素抗性水平呈正相关，抗生素抗性与Zn污染密切相关。此外，从历史数据分析可知，该池塘在使用抗生素之前，其沉积物中已检出较高丰度的抗生素抗性细菌，表明重金属污染对细菌的抗生素抗性产生具有重要影响。与单一抗生素或单一重金属的选择性作用相比，抗生素与重金属协同作用对细菌的选择性作用影响更大[44]。Knapp等[45]检测分析了荷兰不同区域土壤中ARGs丰度，结果表明，当抗生素(包括四环素类、大环内脂类和β-内酰胺酶类)和重金属(包括Cu、Ni和Zn等)同时存在时，土壤中ARGs丰度显著高于仅抗生素或仅重金属存在时的土壤，重金属和抗生素协同作用对ARGs丰度的增殖具有促进作用[46]。与抗生素相比，重金属具有不可生物降解性，其对细菌的选择性作用更为持久。Song等[24]研究发现，农田土壤中的Cu(≥365 mg/kg)和Zn(≥264 mg/kg)能够显著增强细菌对四环素的抗性，但高浓度四环素(100 mg/kg)却未有此效果，重金属对抗生素抗性的选择性作用更强，这主要是因为重金属具有长期生物可利用度，而四环素本身会发生微生物转化和降解，不会在土壤环境中长期稳定存在，因此对土壤微生物的胁迫作用弱于重金属。

2 重金属对ARGs环境行为的影响

2.1 重金属对ARGs丰度的影响

研究表明[47-50]，不同环境介质中重金属浓度与ARGs丰度具有显著相关性，重金属胁迫作用对抗生素抗性微生物具有共选择效应，造成ARGs丰度可维持在稳定水平[51]。Stepanauskas等[25]研究发现，水中Cd暴露能够富集氨苄青霉素抗性病原菌Ralstoniamannitolilytica，提高其抗生素抗性率。He等[52]研究表明，鱼塘中Cu和Zn浓度与tetO、tetQ和sul3基因丰度显著相关，Cu和Zn暴露能够促进ARGs增殖，四环素类和磺胺类ARGs总丰度分别提高约10%和27%。Ding等[44]同样报道，Cu和Zn暴露对四环素抗性具有协同作用，当Zn或Cu与土霉素同时存在时，培养体系中四环素抗性基因相对丰度分别为仅土霉素暴露时的1.5和1.2倍。Ji等[47]研究发现，饲养场周边土壤中ARGs丰度与其对应抗生素浓度的相关关系不显著，但与Cu、Zn和Hg等重金属浓度显著相关，重金属对ARGs丰度具有重要影响。Hu等[53]研究表明，土壤长期(4～5年)Cu污染对ARGs的多样性和相对丰度均会产生影响，当土壤中Cu浓度为100～200 mg/L时，被检出的ARGs数量最多，相比之下，潮土中ARGs相对丰度随着Cu浓度的提高而升高，并在Cu浓度为800 mg/L时达到峰值，这可能与土壤pH影响Cu生物可利用性密切相关。还有研究表明[54]，土壤长期Ni污染暴露会导致ARGs种类和丰度的升高，当Ni浓度为400 mg/L时，潮土中ARGs数量从61～72显著升至114～121，而红壤中ARGs数量同样从45～64升至116～126，这可能是由于Ni生物可利用性和可移动基因元件的影响造成的。同样地，Zhang等[55]通过对农田土壤中重金属和ARGs水平检测分析发现，Zn和Cu浓度对sul1基因相对丰度具有显著影响。

2.2 重金属对ARGs水平转移的影响

重金属胁迫作用对ARGs的散播和转移具有重要影响[54]。Wang等[51]研究报道，水中典型重金属Cu能够促进RP4质粒介导的ARGs接合转移，当Cu2+浓度为0.05～0.5 μg/L时，ARGs接合转移率随Cu2+浓度的升高而升高，Cu2+浓度为5.0 μg/L时，ARGs接合转移率比空白对照提高了16倍，这主要是因为Cu胁迫能够造成供体细菌细胞损伤，促进ARGs发生转移。相比之下，当Cd2+浓度为0.05～200 μg/L时，RP4质粒介导的ARGs接合转移率随Cd2+浓度的升高而降低，这与其刺激细菌细胞分泌EPS有关，EPS的大量生成可阻碍细胞之间相互接触，抑制ARGs水平转移。Lu等[56]研究发现，纳米银(AgNPs)和Ag+均可促进RP4质粒介导的ARGs在不同细菌菌属间发生水平转移，在AgNPs浓度为0.1 μg/L条件下交配6 h后，RP4质粒从大肠杆菌转移至恶臭假单胞菌的效率提高了0.8倍。此外，当Ag+浓度为0.01～10 μg/L时，RP4质粒转移率随Ag+浓度的升高而升高，当Ag+浓度为10 μg/L时，其转移率约为空白对照的2.4倍。AgNPs和Ag+暴露能够诱导产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，造成细菌细胞膜损伤并作出应激响应，从而促进RP4质粒发生水平转移。细胞膜致密性是功能基因在细菌种属间水平转移的天然屏障，因此细胞膜损伤或破裂可促进基因水平转移的发生，从而导致ARGs的散播[57-59]。

在ARGs水平转移过程中，全局调控基因korA、korB和trbA主要负责质粒pCM184-Cm的转移、复制和稳定性，进而调控其转移过程。Zhang等[60]研究表明，当Cu2+、Ag+、Cr6+和Zn2+暴露浓度分别为0.01、0.01、0.1和0.05 mg/L时，korA、korB和trbA基因表达水平出现不同程度的下调，其中korA基因表达水平下调程度分别达56.8%、33.2%、10.1%和44.3%。类似地，Pu等[61]研究发现，亚抑制浓度的Cd2+暴露可显著提高RP4质粒的接合转移率，浓度为1～100 mg/L的Cd2+能够显著提高细菌细胞膜渗透性，当Cd2+浓度为100 mg/L时，交配导致形成基因trbBp的表达水平及DNA转移水平显著升高，促进质粒接合转移。