王海永，徐敏，李晓军（1.南京中医药大学附属医院检验科，南京1000；.东部战区总医院中心实验科，南京1000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性的、炎症性的自身免疫性疾病［1］，病因复杂，发病机制尚不清楚。目前，多项研究证实RA患者体内存在针对瓜氨酸化组蛋白的自身抗体［2-3］以及针对天然组蛋白的自身抗体［4-5］，提示组蛋白可能与RA的发生与发展有关。本课题组前期利用质谱和生物信息学分析技术，对RA患者关节滑膜组织中的蛋白质进行鉴定和分析发现组蛋白H2A在RA患者滑膜组织中有差异性表达［6］。为进一步验证质谱鉴定的结果，本研究通过在大肠埃希菌中原核表达并纯化组蛋白H2A，以H2A作为靶抗原，建立检测血清中抗H2A抗体的间接ELISA技术，比较分析RA患者和健康人对照血清中的抗H2A抗体水平。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集自2016年2月至2017年1月东部战区总医院的门诊和住院RA患者共50例，其中男性13例，女性37例，年龄（47.4±16.8）岁，纳入条件符合2010年美国风湿病学学会／欧洲抗风湿病联盟（ACR／EULAR）的诊断标准［7］，排除合并严重内外科疾病以及其他自身免疫病如系统性红斑狼疮、多发性硬化症以及干燥综合征的病例。健康人对照50例，来自本院体检健康者，男性13例，女性37例，年龄（38.6±12.3）岁，排除有明显自身免疫倾向的健康者。抽取研究对象早晨空腹静脉血3～5 mL，3 500 r／min离心5 min分离血清，血清贮存于－70℃冻存备用，无脂血、溶血等情况。

1.2 菌株、载体、主要试剂和仪器 表达宿主菌BL21（DE3）（北京TransGen生物技术公司），表达载体pET28a（东部战区总医院中心实验室保存），PCR引物（美国Invitrogen公司），限制性内切酶Eco RⅠ、NdeⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、PCR反应缓冲液和核酸标准相对分子质量（大连TakaRa公司），质粒抽提纯化试剂盒及DNA凝胶电泳回收试剂盒（美国Axygen公司），异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，德国Merck公司），Ni-resin（德国Novagen公司），BCA蛋白质定量试剂盒（上海碧云天公司），抗H2A抗体阳性血清、HRP－抗人IgG（美国Sigma公司），PTC-200 PCR基因扩增仪（美国MJResearch公司），酶联仪、蛋白质电泳仪（美国Bio-Rad公司），超声粉碎仪（美国Sonics公司）。

1.3 引物设计与合成 根据H2A基因cds序列和pET28a表达载体的MCS位点，设计特异性PCR引物，用于扩增H2A基因，H2A-F1：5′-TTCCATATGTC TGGACGTGGCAAGCAGGGA-3′，H2A-R1：5′-CCGG AATTCTTACTTGCCCTTCGCCTTGTGGT-3′；其 中H2A-F1中含有NdeⅠ酶切位点；H2A-R1中含有Eco RⅠ酶切位点。

1.4 H2A／pET28a重组质粒的构建 RT-PCR扩增H2A基因，利用限制性内切酶Eco RⅠ／NdeⅠ同时双酶切PCR产物和pET28a表达载体，目的片段经T4 DNA连接酶连接后转化BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落，抽提质粒，测序验证，验证正确的重组质粒命名为H2A／pET28a。

1.5 组蛋白H2A的原核表达及纯化 利用IPTG诱导融合蛋白的表达，完毕后收集菌体，超声波破碎，离心并分别收集上清液和沉淀，SDS-PAGE鉴定蛋白质表达情况。确定蛋白质正确表达后，纯化H2A重组蛋白。SDS-PAGE检测蛋白质纯度，BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。

1.6 重组蛋白的western blot鉴定 将纯化的重组蛋白H2A经SDS-PAGE后转PVDF膜，50 g／L脱脂奶粉4℃封闭过夜，用抗核抗体检查中抗组蛋白抗体阳性血清及HRP－抗人IgG分别作为第一抗体、第二抗体进行温育，加入化学发光试剂进行显色反应。

1.7 间接ELISA法的建立 以纯化的H2A蛋白为包被抗原，HRP－抗人IgG为二抗，建立检测抗H2A抗体的间接ELISA方法。用棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳包被浓度（10、5、2.5、1μg／mL），最佳血清稀释度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800），最佳二抗稀释度（1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000）。（1）包被：将H2A用包被缓冲液稀释至5μg／mL，包被聚乙烯ELISA板，每孔100μL，置4℃过夜，用PBST洗板3次，每次3 min，拍干；（2）封闭：每孔加100μL用PBST稀释的50 g／L脱脂奶粉封闭，置于4℃过夜，用PBST洗板3次，每次3 min，拍干；（3）加血清样本：将RA组、健康人对照组、阳性对照和阴性对照血清按1∶400稀释，每个样本重复3孔，每孔加入100μL，置37℃反应1 h，洗板3次，每次3 min，拍干；（4）加二抗：将HRP－抗人IgG按1∶20 000稀释，每孔加入100μL，置37℃反应1 h，洗板5次，每次3 min，拍干；（5）显色与终止：加显色液A和显色液B，室温避光反应10 min，加终止液终止反应；（6）读板：酶联仪检测A450nm值。

1.8 统计学分析 采用GraphPad Prism 6软件进行统计学分析。RA患者与健康人对照组数值用均数±标准差表示，比较采用独立样本t检验。率的比较用卡方检验。以P＜0.05为有统计学意义。绘制ROC曲线，用ROC曲线下面积（AUCROC）评估抗H2A抗体作为诊断指标的潜力。

2 结果

2.1 重组质粒H2A／pET28a的鉴定 经PCR扩增、限制性酶切、DNA连接、转化、克隆鉴定等步骤，成功构建重组质粒H2A／pET28a，图1为重组质粒 H2A／pET28a的DNA测序结果。

图1 重组质粒H2 A／pET28a的DNA测序结果

2.2 重组蛋白的原核表达与纯化 原核表达质粒H2A／pET28a体外诱导表达后经SDS-PAGE检测分析，结果显示，在相对分子量15 000处有预期大小的蛋白质条带，且该条带在上清液和沉淀中都有表达，结果见图2（1～5）。进一步利用His标签蛋白纯化试剂盒对H2A重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE结果显示，在相对分子量15 000处有单一条带，灰度分析显示蛋白质纯度大于90%，结果见图2（6～8泳道）。

图2 重组H2A蛋白的表达与纯化

2.3 重组蛋白的western blot鉴定 用抗组蛋白抗体阳性血清鉴定纯化的重组H2A蛋白，western blot结果显示，在相对分子量15 000处有一条清晰的条带，见图3。

图3 重组H 2A蛋白的western blot鉴定

2.4 间接ELISA反应条件的优化 用棋盘滴定法对实验条件进行优化。选择强阳性血清的A值在1.0左右、阴性血清的A值小于0.1的条件作为最适条件，结果显示，H2A蛋白最佳包被浓度为5μg／mL，待测血清最佳稀释度为1∶400，HRP－抗人IgG最佳稀释度为1∶20 000。

2.5 特异性考察 方法特异性考察采用抗体阻断试验。选择抗H2A抗体强阳性的血清作1∶400稀释，并加入H2A抗原至终浓度分别为0、0.5、1、2μg／mL，37℃温育1 h后，12 000 r／min离心10 min，取上清液进行抗H2A抗体检测。结果显示，经H2A吸收过的强阳性血清，其A值随加入的H2A量的增加而降低，当H2A的终浓度达到2μg／mL时，A值从1.207降低至0.405，阻断率为66.4%，见图4。

图4 特异性阻断抑制试验

2.6 重复性试验 批内重复性试验：使用同一批次纯化的H2A蛋白包被酶联板，对10份高、中、低3个浓度的抗H2A抗体样本进行检测，每个样本重复3孔。批间重复性试验：使用3个批次纯化的H2A蛋白包被酶联板，检测同样的10份血清样本。计算批内和批间变异系数。结果显示，批内变异系数分别为5.1%、7.5%和6.6%，批间变异系数分别为7.7%，9.5%和8.4%，均小于10%，表明该方法重复性较好。

2.7 抗H2A抗体用于RA诊断的效果 按照优化的反应条件对50份RA组和50份健康人对照组血清进行测定，以不同的A值制作ROC曲线，计算ROC曲线下面积（AUCROC）。抗H2A抗体诊断RA的AUCROC为0.884，标准误为0.030，P＜0.01，95%可信区间为0.819～0.948。当A＝0.494时，敏感性为84%，特异性为80%，敏感性、特异性最高，故以0.494为cut-off值。

2.8 临床样本检测 用建立的间接ELISA方法测定50份RA组和50份健康人对照组血清，结果显示，50例RA患者血清的A值为0.930±0.546，50例健康人对照组血清的A值为0.367±0.203，RA患者血清抗H2A抗体水平明显高于健康人对照组，差异有统计学意义（t＝6.834，P＜0.01）。该法测得RA患者血清抗H2A抗体的阳性率为84%（42／50），明显高于健康人对照组20%（10／50），差异有统计学意义（χ2＝41.026，P＜0.01）。

3 讨论

2010年ACR／EULAR将类风湿因子（RF）和抗瓜氨酸化肽抗体（ACPA）纳入RA的分类标准中，但是RF的特异性较差，还可见于其他的风湿性疾病、慢性炎症患者以及老年人中［8］；ACPA对RA诊断具有较高的特异性，但是仍有约20%的漏诊率。因此，对RA相关生物标志物的研究仍很需要。本研究基于质谱发现，挑选差异蛋白H2A进行验证，探索抗H2A抗体与RA的关系。

本研究构建了含有His标签的H2A／pET28a原核表达载体，以便对重组蛋白进行纯化，纯化的H2A蛋白经western blot鉴定具有良好的反应原性。因此，本实验利用纯化的H2A蛋白作为包被抗原，通过对抗原浓度、血清及酶标二抗稀释度等条件进行优化，建立检测抗H2A抗体的间接ELISA方法。方法学特性验证结果显示，该方法的特异性和重复性均满足临床实验室的要求；对临床样本进行检测发现，RA患者血清抗H2A的敏感性为84%（42／50），特异性为80%（40／50），RA组血清抗H2A抗体的阳性率明显高于健康人对照组，表明可以用间接ELISA检测RA患者血清中抗H2A抗体的水平。由于每次复性的重组蛋白在重复性和稳定性上可能略有差异，以及市场上没有商品化的诊断试剂盒可供参考，这可能会导致建立的ELISA方法存在一定局限性，所以后续仍需进一步扩大样本量，完善优化部分指标，以期获得更为可靠的应用数据。

综上，本研究利用原核表达系统体外表达了重组H2A蛋白，并且建立了检测血清抗H2A抗体的间接ELISA方法，并在临床样本中作初步验证，为后续相关研究提供了依据。