杨为斌，王江平，梅丽萍，蔡望喜（.武汉市普仁医院检验科，武汉43008；.湖北中医药大学附属医院 湖北省中医院检验科，武汉43006）

以系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）和干燥综合征（Sjögren′s syndrome，SS）等为代表的自身免疫病（autoimmune disease，AID）在我国的发病率呈逐年上升趋势。抗干燥综合征抗原A（Sjögren′s syndrome antigen A，SSA）抗体、抗干燥综合征抗原B（Sjögren′s syndrome antigen B，SSB）抗体和抗着丝点蛋白B（centromere protein B，CENP-B）抗体对于AID的临床诊断发挥重要作用。其中，抗SSA和SSB抗体是SS患者中常见的自身抗体，大约50%～70%的SS患者体内可检测到上述2种抗体［1］。抗CENP-B抗体则往往被视为系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc）临床诊断的血清学标记物，该抗体在CREST综合征的发生率高达50%～90%［2］。上述3种抗体在不同疾病中的发生率已有不少文献报道，但已有的研究数据均基于传统免疫学检测方法获得，包括对流免疫电泳、免疫双扩散、免疫印迹法或酶联免疫吸附法等。在国内大部分临床实验室在开展抗SSA、SSB和CENP-B抗体检测时，仍然沿用传统免疫印迹法开展定性检测。近年来，具有全自动、定量、随机上样和灵活组合等特点的化学发光法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）被逐步应用到自身抗体的临床检测领域［3-4］。本研究同时采用CLIA和ELISA对上述3种抗体在SLE和SS等患者人群中的发生率和浓度展开对比研究。同时比较CLIA和ELISA两种方法在检测上述抗体时的符合率。

1 材料与方法

1.1 临床样本 收集2017年1月至2019年6月期间湖北省中医院就诊的531例SLE患者（女480例，男51例，平均年龄36岁）、96例SS患者（女92例，男4例，平均年龄50岁）和93例本院职工体检健康人群（healthy individual，Hi）（女56例，男37例，平均年龄43.5岁）血清样本，样本采集后直接检测或－20℃保存。入组患者的临床诊断均严格遵循相关疾病的临床分类标准［5-6］。其中，Hi组均自述无自身免疫相关疾病病史，且血常规、尿常规、肝功能和免疫指标（含免疫球蛋白和补体）等常规体检指标未见异常。本研究已通过湖北省中医院伦理委员会的伦理审查，所有受试者均签署知情同意书。所有样本同时采用CLIA和ELISA开展抗SSA、SSB和CENP-B抗体的检测。

1.2 试剂和仪器 CLIA自身抗体检测系统：全自动化学发光分析仪（Smart 6500，重庆科斯迈公司）及配套的抗SSA、SSB和CENP-B抗体CLIA检测试剂盒（江苏浩欧博公司）。ELISA检测：SUNRISE酶联仪（瑞士TECAN公司）及抗SSA、SSB和CENP-B抗体ELISA检测试剂盒（德国欧蒙公司）。

1.3 方法

1.3.1 CLIA法检测抗SSA、SSB和CENP-B抗体

均按照试剂说明书操作，在全自动化学发光分析仪（Smart 6500）上检测。临界值均为20 RU／mL。

1.3.2 ELISA法检测抗SSA、SSB和CENP-B抗体 血清标本1∶201稀释，加入包被特定靶抗原的微孔板中，室温反应30 min，用清洗缓冲液清洗3次，每孔加入100μL酶标记的抗人IgG抗体，室温反应30 min，用清洗缓冲液清洗3次，每孔加入100μL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物液，室温反应15 min，最后加入100μL终止液，在酶联仪中以450 nm和620 nm双波长测量吸光度测量。根据吸光度值计算抗体浓度并判读阴阳性结果。所有ELISA抗体的检测临界值均为20 RU／mL。

1.3.3 统计学分析 用SPSS21.0软件进行。相关组别的抗体浓度比较采用t检验分析；不同样本组抗体发生率差异采用χ2检验。不同方法检测结果差异的比较，采用四格表的χ2检验，两种方法检测结果一致性的分析采用Kappa检验，一致性强度的判断：当Kappa＜0.4，一致性强度较差；0.4≤Kappa＜0.75，两者一致性一般；Kappa≥0.75两者一致性较好。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗SSA、SSB和CENP-B抗体在SLE和SS的发生率及浓度 CLIA法结果显示：SLE患者组的抗体发生率分别为63.3%、17.5%和9.2%，SS患者组的抗体发生率则分别为84.4%、40.6%和7%。抗SSA和SSB抗体在SS患者组的发生率均高于SLE患者组（P＜0.01），而抗CENP-B抗体在上述2种疾病中的发生率差异无统计学意义（P＞0.05）。抗SSA抗体浓度在上述两组患者中差异无统计学意义（P＝0.09），而抗SSB和CENPB抗体的浓度差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1和表2。

表1 抗SSA、SSB和CENP-B抗体在不同疾病组的抗体发生率比较

表2 抗SSA、SSB和CENP-B抗体在SLE和SS患者的抗体浓度比较（¯x±s，RU／mL）

2.2 抗SSB抗体和抗SSA抗体的相关性 入组样本中抗SSB抗体阳性134例，其中抗SSA抗体阴性而抗SSB抗体阳性的例数仅为4例。结果表明，无论是在SLE还是SS患者人群中，抗SSB抗体的发生总是伴随抗SSA抗体的存在，呈现对抗SSA抗体的高度依赖性（P＜0.05）。见表3。

表3 抗SSB抗体伴随抗SSA抗体发生率［n（%）］

2.3 CLIA和ELISA 2种方法检测抗SSA、SSB和CENP-B抗体的符合率 本研究对所有样本同时平行开展CLIA和ELISA检测。结果显示，CLIA和ELISA在检测上述3种抗体时总符合率分别为96.4%、95.7%和98.3%（Kappa＞0.85），提示CLIA和ELISA 2种方法对3种抗体的检测结果具有可比性。见表4。

表4 CLIA与ELISA检测抗SSA、SSB和CENP-B抗体的符合率（%）分析

3 讨论

随着环境的改变以及老龄化程度的增加，国内AID的发病率呈现逐年上升的趋势。在临床实践中，与AID相关的自身抗体实验室检测结果对于疾病的临床诊断和治疗监测发挥重要作用。抗SSA抗体和抗SSB抗体由于在SS患者中具有较高的发生率，因此对SS的临床诊断具有重要价值。而抗CENP-B抗体则被认为是SSc的重要血清学标记物。已有的研究表明，上述3种抗体在包括SLE、原发性胆汁性胆管炎、类风湿关节炎等AID中均有不同的发生率［7-9］。但大部分针对上述抗体发生率研究所采用的方法学均为传统免疫方法，例如免疫双扩散法、对流免疫电泳、ELISA或免疫印迹法（line immunoassay，LIA）等。不同检测方法学由于检测原理不同，因此不同方法学检测结果往往容易存在差异。目前，国内针对上述3种抗体在SLE和SS发生率和浓度的研究比较少见。本研究应用CLIA和ELISA方法对临床确诊的患者开展上述3种抗体的平行检测，从而探讨上述3种抗体在国内SLE和SS患者的抗体发生率以及浓度。结果显示，抗SSA和SSB抗体在SLE和SS患者组中均具有较高的发生率，抗SSA抗体的发生率分别为63.6%和84.4%，抗SSB抗体的发生率分别为17.5%和40.6%。本研究中抗SSB抗体在SS确诊患者组中的发生率明显高于Yang等［10］采用LIA方法的研究结果（25.3%）。值得注意的是，抗SSB抗体不仅发生率SS患者组高于SLE组，而且该抗体在SS组中的浓度显著高于SLE患者（P＜0.01）。在临床实践中，SS患者包括原发和继发两类患者。其中，17.8%的SLE患者可继发出SS，从而在临床表现出上述2种疾病的重叠（SLE-SS）。SLE-SS与单独SLE相比较，不仅临床表现有所不同，而且自身抗体的表现也存在差异，其中抗SSA和SSB抗体在SLE-SS患者组中的发生率明显高于单独SLE组［11］。本研究结果显示，抗SSB抗体在SS患者组的发生率和浓度均显著高于SLE组，提示与抗SSA抗体相比，抗SSB抗体在SS疾病的发病过程中可能发挥更重要的作用。

已有的研究表明，抗SSA抗体和抗SSB抗体具有不同的疾病特异性。前者在多种AID疾病中均有一定的发生率，包括SLE、SS和类风湿关节炎等，而后者则对SS具有更高的疾病特异性。在本研究中，抗SSB抗体尽管在SS的发生率明显高于SLE，但该抗体的出现始终伴随着抗SSA抗体的阳性。作为真核细胞内的重要核糖核蛋白分子，SSA和SSB抗原在结构上具有一定的关联性。天然的SSA和SSB抗原的共同特点都是由一个核糖核蛋白与特定小分子核酸（hY-RNAs）组成的复合物。与SSA抗原中相对分子质量为60 000的蛋白质分子相结合的hY-RNAs分子，同时也具有与SSB抗原中相对分子质量为48 000的蛋白质分子结合的位点。相对分子质量为60 000和48 000的结合蛋白的分子量不同，但由于可结合在同一hY-RNAs分子上，因此在抗原结构上相关性也使得其临床发生率具有一定的相关性［12］。本研究中所使用的CLIA方法在检测抗SSA和SSB抗体时均使用天然抗原，而检测结果也显示出抗SSB抗体的发生率具有抗SSA抗体的依赖性。最近的研究表明，抗SSA抗体与SLE患者的头疼、视力模糊以及疾病活动度相关，而抗SSB抗体则与SLE患者的头疼和疾病活动度相关，且上述2个抗体在SLE患者中往往同时出现［13］。对于单独抗SSA抗体阳性的SLE和SS患者与2个抗体同时阳性的患者之间，是否存在更多的临床差异（包括临床表征、疾病进程和疗效预后等），仍需要更多的临床分组研究具体解答。

抗CENP-B抗体一直以来都作为SSc疾病的血清学标志物，尤其与具有钙化、雷诺现象、食管运动障碍、指端硬化和毛细血管扩张为主要表现的CREST综合征高度相关。越来越多的研究表明，抗CENP-B抗体同样可以在其他自身免疫疾病中出现，包括SLE、SS、原发性胆汁性胆管炎和类风湿关节炎等。随着研究的不断深入，抗CNEP-B抗体阳性的SS患者与抗体阴性患者相比，由于具有雷诺现象、指端硬化和合并自身免疫甲状腺炎的概率更高，因此该抗体阳性的SS患者被视为一个独特的临床 亚 型［14］。Respaldiza等［15］研 究 显 示，抗CENP-B抗体在SLE的发生率仅为1.9%。在本研究中，抗CENP-B抗体在SLE的发生率高达9.2%。差异造成的原因有可能是Respaldiza等［15］的研究所采用的方法学均为传统的检测方法，包括间接免疫荧光法、ELISA、western blot等，对于抗CENP-B抗体的检测敏感性偏低。

本研究对所有样本同时采用CLIA和ELISA平行检测结果显示，2种方法在检测上述3种抗体时表现出良好的符合率和一致性。尽管CLIA和ELISA在抗原包被和反应原理上存在一定的差异，但由于2种方法针对上述3种抗体的检测均采用了相同来源的抗原成分（SSA和SSB均采用天然抗原，而CENP-B同为重组抗原），确保2种方法学在检测上述3种抗体时具有良好的符合率。实验室开展自身抗体检测方法学选择之前，应根据方法学性能参数等多因素综合评判。