邱方，诸萍，王婵，江鹏，刘向东（1.南京医科大学第四附属医院检验科，南京10031；.东南大学生命科学与技术学院，南京10096）

原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一种累及肝内胆管系统的慢性进行性自身免疫病，实验室检查常见血清碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性持续异常升高、抗线粒体抗体－M2（anti mitochondrial antibody-M2，AMA-M2）阳性，病理学检查显示肝脏内非化脓性胆汁淤积和小叶间胆管炎性损伤，只要符合两点即可确 诊［1-2］。熊 去 氧 胆 酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是美国和欧洲肝病学会推荐的PBC治疗唯一的一线药物，能有效改善PBC的自然病史，但有约40%的患者对UDCA无药物生化应答［1］。多个基于生化变量的预后预测量化模型已广泛应用于PBC患者的风险分层管理，其中清蛋白（albumin，Alb）－胆红素（bilirubin，TBil）评分（ALBI）是近年来被用于PBC预后预测的新模型，被证实与Mayo评分等主要预后评价标准及肝脏组织学有很好的相关性［3-4］。

AMA-M2阳性率在PBC中可达90%～95%，其靶抗原是线粒体内膜上的2－氧酸脱氢酶复合体（2-OADC），识别的抗原表位是2-OADC的主要组分丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）、支链二酮酸脱氢酶复合体E2（BCOADC-E2）和2－酮戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）［5］。国外学者曾对PBC患者上述抗原表位分布进行分析，但未进一步研究不同抗原表位的临床价值，国内也未见此类报道。本研究拟分析374例汉族PBC患者PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2 3种AMA-M2抗原表位的分布情况，并探讨其临床价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取江苏省PBC研究协作组建立的PBC生物样本库保存的2008年至2014年有完整临床资料的汉族PBC患者血清标本374例（主要来自苏州市第五人民医院、无锡市第五人民医院、镇江市第三人民医院、南京市第二医院、东部战区总医院秦淮医疗区、常州第三人民医院），其中男63例，女311例，年龄（55.6±11.8）岁。所有纳入分析的患者均符合以下标准：（1）AMA-M2血清学检测呈阳性；（2）生化胆汁淤积指标（如ALP和TBil）异常升高；（3）各类肝炎病毒感染指标阴性；（4）无血吸虫感染史、药物性肝炎史、酒精性肝炎病史。AMA-M2血清学检测结果均经东南大学教育部发育与疾病相关基因重点实验室建立的酶联免疫吸附法（ELISA）检测验证，该方法与商品化AMA-M2 ELISA试剂盒检测结果比较符合率为98.3%［6］。其中，184例PBC患者有跨度在1年以上的多次临床资料，可用于UDCA药物生化应答情况的分析。

1.2 临床资料收集 计算ALBI评分，公式：ALBI＝0.66×lg［TBil（μmol／L）］－0.085×［Alb（g／L）］。ALBI分级标准：1级，ALBI评分≤－2.60；2级，－2.60＜ALBI评分≤－1.39；3级，ALBI评分＞－1.39，1、2、3级PBC预后不佳的风险依次升高［3］。采用巴黎Ⅰ标准［2］对PBC患者进行UDCA生化应答分类，有生化应答的判断标准如下：UDCA治疗1年后，ALP≤3×正常上限（upper limit of normal，ULN），天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）≤2×ULN，TBil≤17.1μmol／L。

1.3 主要仪器与试剂 96孔酶联板（Thermo公司），1575洗板机、iMark酶标仪（Bio-Rad公司），小牛血清（BSA，Sigma公司），辣根过氧化酶标记抗人IgG抗体（Millipore公司）。pET28a载体、GB05-Dir大肠埃希菌（东南大学教育部发育与疾病相关基因重点实验室保存）。

1.4 PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重组蛋白的制备 采用Red／ET重组技术制备PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重组蛋白［6-7］。应用Primer Premier 3.0软件设计含Red／ET重组同源臂的引物，引物序列见表1，由南京金斯瑞公司合成。以HepG2细胞cDNA为模板，用PCR技术扩增PDC-E2 cDNA（1 686 bp）、BCOADC-E2 cDNA（1 260 bp）和OGDC-E2 cDNA（1 161 bp）。采用Red／ET重组技术将扩增的cDNA与pET28a载体共同转入GB05-Dir大肠埃希菌中，送南京金斯瑞公司进行Sanger法基因测序比对后，将正确的克隆导入大肠埃希菌BL21中大量诱导表达，获得N端带有6-His标签的PDC-E2、BCOADC-E2和C端带有6-His标签的OGDC-E2重组蛋白。经Ni-NTA凝胶纯化后，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测鉴定。

表1 各抗原表位蛋白cDNA PCR扩增引物

1.5 ELISA方法的建立 分别以PDC-E2（100 ng）、BCOADC-E2（100 ng）和OGDC-E2（300 ng）为靶抗原，4℃过夜包被酶联板，次日使用1575洗板机，用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗板4次。用1%小牛血清（BSA）封闭酶联板反应孔，室温放置2 h后，用PBST洗板4次。待测样本用1%BSA按1∶1 000稀释，取100μL加入反应孔，经室温温育1 h后用PBST洗板5次。用1%BSA按1∶50 000稀释辣根过氧化酶标记抗人IgG抗体，取100μL加入反应孔，经室温温育1 h后用PBST洗板5次，分别加入底物B（过氧化氢溶液）和底物A（四甲基联苯胺溶液）各50μL，室温放置20 min，加入终止液（H2SO4溶液）50μL，用iMark酶联仪测定450 nm波长处吸光度值（A值）。结果判定：分别测定20例AMA-M2阴性的健康人血清，计算A均值和标准差（s），以A均值＋3s为cut-off值，大于cut-off值判定为有反应性。

1.6 统计学分析 用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料中多组数据比较采用K-W检验，两组间数据比较采用Mann-Whitney U检验；分类变量比较采用Pearson卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重组蛋白的鉴定 SDS-PAGE结果见图1。

图1 SDS-PAGE鉴定纯化后3种AMA-M2抗原表位的重组蛋白

2.2 3种AMA-M2抗原表位与PBC患者血清反应性的分布情况 ELISA测定抗 PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重组蛋白的cut-off值分别为0.332、0.359和0.257。374例PBC患者血清与PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2 3个抗原表位有反应性的比例分别为86.6%（324／374）、88.0%（329／374）和35.0%（131／374），有3例与3个抗原表位均无反应性，但其AMA-M2检测结果为阳性。PBC患者血清对PDC-E2＋BCOADC-E2＋OGDC-E2、PDC-E2＋BCOADC-E2、PDC-E2、BCOADC-E2、PDC-E2＋OGDC-E2、BCOADC-E2＋OGDC-E2和OGDC-E2有反应性的例数分别为119、164、33、43、8、3和1例，PDC-E2＋BCOADC-E2＋OGDC-E2、PDC-E2＋BCOADC-E2、PDC-E2、BCOADC-E2是PBC患者血清有反应性的常见抗原表位反应模式，分别以A、B、C和D模式表示。

2.3 常见抗原表位反应模式间PBC患者ALBI分级结果的比较 根据ALBI公式计算PBC患者的评分结果，按照分级标准分为ALBI-1、2、3级。4种常见抗原表位反应模式间A模式ALBI-1患者比例低于C和D模式，ALBI-3级患者比例高于C和D模式，差异有统计学意义（χ2分别为14.174和14.167，P均＜0.05）。B模式ALBI-1级患者的比例低于C和D模式，差异有统计学意义（χ2分别为10.350和9.510，P均＜0.05）。见表2。

表2 常见抗原表位反应模式间PBC患者ALBI分级情况比较［n（%）］

2.4 UDCA生化应答和不应答患者间3种抗原表位分布比较 采用巴黎Ⅰ标准对有治疗1年前后生化检验结果的184例患者进行UDCA药物生化应答分类，应答和不应答患者各有95例和89例，药物应答比例为51.6%。不应答患者血清与BCOADC-E2的反应率（89.9%）高于不应答者（77.9%），差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。C模式中不应答患者的比例高于A、B和D模式，差异有统计学意义（χ2分别为5.096、9.403和7.993，P均＜0.05），见表4。

表3 应答和不应答患者间抗原表位反应率比较

表4 常见抗原表位反应模式间应答和不应答患者分布比较［n（%）］

3 讨论

上世纪60年代Walker等发现PBC患者血清中存在AMA，80年代Gershwin等发现并成功克隆AMA的抗原表位PDC-E2，90年代进一步确认BCOADC-E2和OOGDC-E2也是AMA的抗原表位［8］。

欧美学者采用免疫印迹法检测PBC患者血清与PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2的反应率分别为81.7%、59.1%和27.4%［9］，与本研究结果的86.6%、88.0%和35.0%有一定的差异，尤其是BCOADC-E2。本研究采用的BCOADC-E2是全长片段，Leung等［10］认为AMA-M2的结合能力与BCOADC-E2肽段的长度呈正相关，这可能是导致结果差异的主要原因。PBC患者血清与3个抗原表位的反应模式共有7种，本研究结果表明汉族PBC患者以PDC-E2＋BCOADC-E2＋OGDC-E2（A模式）、PDC-E2＋BCOADC-E2（B模式）、PDC-E2（C模式）和BCOADC-E2（D模式）4种反应模式为主。分析抗原表位与PBC预后不佳的风险程度的关系表明，PBC预后不佳高风险级的ALBI-3级患者在A、B、C和D模式中的比例依次降低，其中A与C、D模式的差异均具有统计学意义，提示不同抗原表位对PBC预后的影响存在叠加效应，与PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2 3个抗原表位同时有反应性的PBC患者疾病预后不佳的风险较高。

本研究采用被美国肝病学会认为最简单有效的巴黎Ⅰ标准对PBC患者UDCA生化应答进行分类［2］，并分析应答和不应答患者血清与3个AMA-M2抗原表位和常见抗原表位反应模式分布的差异，结果表明不应答患者对BCOADC-E2的反应率明显高于应答组，但应答组的阳性率也高达77.9%。本研究结果还显示仅与BCOADC-E2有反应的UDCA应答PBC患者比例是不应答患者的2倍，仅与PDC-E2有反应的不应答患者比例则远高于应答患者，而与3个或2个抗原表位同时有反应性的应答和不应答患者的比例相差却不明显。提示BCOADC-E2和PDC-E2抗原表位可能与UDCA应答相关，但可能存在交互作用。在今后的研究中需要通过定量方法确定2类患者血清与BCOADC-E2和PDC-E2反应强度的差异，并跟踪其反应强度及肝功能生化指标的动态变化，分析其与UDCA疗效的相关性。