张强，张敏，黄志荣，王高，胡中立，章智华

江西中医药大学附属洪都中医院，江西 南昌 330006

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是于老年人群中高发的慢性疾病之一，退行性病理改变是KOA 的发病基础，膝关节肿痛、弹响以及坐立走行膝关节都活动不便为患者的一般症状表现，KOA 病情严重会发展成膝关节的严重障碍甚至是畸变，严重影响患者身心健康、自理能力以及加重家庭负担［1-3］。临床认为，肥胖所致膝关节压力过大及磨损、膝骨外伤以及机体过劳都是导致KOA 疾病的主要原因［4］。如今，人口肥胖率升高，KOA 患病率也升高，所以，加强KOA 的防治措施，对于患者以及社会都有着十分积极的意义［5］。而目前医学界对于该病诊断治疗尚且没有特异性和有效率都较高的办法，通过减轻关节磨损缓解病情是临床的主要应对措施［6］。为了提高患者的治疗体验及效果，无创生化指标来测评KOA 病情以及预后逐渐成为学术界争相研究的一大热点［7］。相关研究显示，角蛋白（AKA）、核周因子（APF）以及瓜氨酸（anti-CCP）抗体等三种特异性自身抗体在KOA 患者空腹血中的表达较正常人出现异常，而临床研究表明KOA疾病的发生发展与淋巴细胞凋亡出现异常存在关系［8］。因此本研究旨在研究AKA、APF 以及anti-CCP 抗体等三种特异性自身抗体对KOA 细胞凋亡影响,为KOA 患者提供诊断和治疗思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2018年3 月至2019年10 月期间江西中医药大学附属洪都中医院收治的82 例KOA 患者为研究组，招募82 例健康志愿者为对照组。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，详见表1。参试者及近亲属签署了试验知情同意书，本研究符合医学伦理原则要求。

表1 研究组和对照组一般资料比较

1.2 入选标准

纳入标准：（1）研究组患者符合KOA 临床诊断标准；（2）对照组无关节疾病。排除标准：（1）合并肿瘤；（2）类风湿性关节炎以及除KOA 以外的其他关节性疾病；（3）免疫系统及其他内科疾病患者；（4）精神病患者。

1.3 KOA 严重程度分组标准

根据Kellgren-Law-rence（K-L）标准分级，膝关节检测正常为0 级；膝关节有微小骨质增生现象为Ⅰ级；膝关节间隙窄，轻度骨赘为Ⅱ级；膝关节骨赘变多骨质硬化为Ⅲ级；膝关节骨赘大量增多、骨质严重硬化畸变，伴随关节的不同程度脱位为Ⅳ级。将KOA 患者分为KOA 轻、中、重度三个亚组，0～Ⅰ级为轻度组；Ⅱ级为中度组；Ⅲ～Ⅳ级为重度组。

1.4 检测特异性自身抗体

IIF 法:抽取患者清晨空腹静脉血，离心分离取上清，经过稀释后若所测抗体呈阳性，继续稀释，直到测定最终稀释度，测定过程按IIF 试剂盒说明严格操作。ELISA 法：首先对各组血清进行稀释，全程反应60 min，待反应结束后读取吸光度值，采用直线回归计算样本浓度，阳性标准为100 U/mL及以上，试剂盒均来自北京博尔迈生物科技有限公司，过程按相应的试剂盒操作说明书。

1.5 检测淋巴细胞凋亡率

抽取的各组静脉血首先采用肝素抗凝血，然后分离T、B 淋巴细胞。将细胞于FCM 管低温PBS 液洗涤、离心、弃上清，再加入缓冲液，血细胞分析仪进行细胞计数，再使用摇床混匀，PI 染料进行避光染色，流式细胞仪检测细胞凋亡，并记录凋亡细胞占所有细胞的比率，具体数值以百分数形式表示。所涉及的仪器来自美国贝克曼公司。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各亚组分组情况及资料

如表2，根据K-L 分级标准将研究组KOA 患者 分 为KOA 轻 度 组27 例，KOA 中 度 组36 例，KOA 重度组19 例。四组在男女比例、年龄以及BMI 水平均差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 各亚组分组情况及资料

2.2 各组特异性自身抗体的表达比较

如下图1，通过对比对照组和研究组KOA 患者血清中特异性自身抗体AKA、APF 以及anti-CCP的表达：研究组中三者的表达较对照组显著上调（P<0.05）。不同严重程度分组比较：与轻度组比较，中、重度组患者血清中AKA、APF、anti-CCP 的相对表达显著升高（P<0.05）。，见表3。

表3 对照组及KOA病情不同严重程度亚组中的表达比较（）

表3 对照组及KOA病情不同严重程度亚组中的表达比较（）

注：a表示与对照组比较，P<0.05；b表示与KOA轻度组比较，P<0.05；c表示与KOA中度组比较，P<0.05。

图1 对照组及研究组血清中特异性自身抗体的表达

2.3 各组T、B 淋巴细胞凋亡率结果比较

与对照组比较，KOA 轻度组患者的T、B 淋巴细胞凋亡率较对照组有降低的趋势，差异无统计学意义（P>0.05）；KOA 中、重度组患者T、B 淋巴细胞凋亡率较轻度组显著降低（P<0.05），见图2和表4。

图2 T、B淋巴细胞凋亡流式细胞图

表4 对照组及KOA病情不同严重程度亚组淋巴细胞凋亡率比较（%，）

表4 对照组及KOA病情不同严重程度亚组淋巴细胞凋亡率比较（%，）

注：a表示与对照组比较，P<0.05；b表示与KOA轻度组比较，P<0.05；c表示与KOA中度组比较，P<0.05。

2.4 特异性自身抗体对KOA 的诊断价值

如表5、图3 所示，ROC 曲线分析的结果显示：特异性自身抗体AKA、APF 以及anti-CCP 对KOA均具有良好的诊断价值。

表5 特异性自身抗体与KOA病情程度ROC曲线分析结果

图3 特异性自身抗体与KOA病情程度ROC曲线分析

2.5 影响因素分析

logistic 回归分析结果：血清特异性自身抗体AKA、APF、anti-CCP 均是影响KOA 患者病情程度的独立危险因素（P<0.05）。，见表6。

表6 影响KOA病情的Logistic回归分析

2.6 特异性自身抗体与淋巴细胞凋亡率的相关性分析

相关性分析结果显示：特异性自身抗体AKA、APF 以及anti-CCP 与淋巴细胞凋亡率均呈负相关（R<0，P<0.05）。其中AKA 与B、T 淋巴细胞负相关（R=-0.633，-0.498，P<0.05）；APF 与B、T 淋巴细胞负相关（R=-0.478，-0.654，P<0.05）；anti-CCP 与B、T 淋巴细胞负相关（R=-0.553，-0.378，P<0.05）。见图4。

图4 特异性自身抗体与淋巴细胞凋亡率的相关性分析

3 讨论

KOA 又被称作膝关节增生性关节炎，该病不但发病率高，且预后效果不佳病情迁延难愈，因此该病的临床关注度高［9］。对该病治疗会根据患者病情的轻重程度针对性进行，对于病情较轻患者，康复锻炼以维持膝关节能力；对于病情较重者，采用向关节腔内注射药物治疗；而对于膝关节以及产生严重畸变，关节基本功能丧失则需要进行膝关节置换术及相关手术治疗，而且痊愈的可能性很低［10］。因此，寻找在疾病早期准确检测治疗的方法十分重要［11］。医学研究表示：外来抗原使机体自身产生免疫抵抗，该抗原将HLA-DR 分子呈递给吞噬细胞加工，从而激活机体的T 淋巴细胞，导致KOA。特异性自身抗体是指抗自身抗原的一类免疫球蛋白［12］。相关临床问诊和病历分析AKA、APF、anti-CCP 与KOA 患者关节压痛数以及晨僵时间等疾病相关指标有关，说明其与KOA 病情程度和活动性相关，而临床研究表明KOA 疾病的发生发展与淋巴细胞凋亡出现异常存在关系［13-15］。机体淋巴细胞的凋亡关系到机体免疫系统的正常运转以及能否发挥正常生物学作用［16］，因此探究KOA 患者特异性自身抗体的表达对机体淋巴细胞凋亡的影响有着十分重要的临床意义。

本研究通过IIF 法联合ELISA 法测定AKA、APF、anti-CCP 等特异性自身抗体在KOA 不同病情患者中的表达，分析KOA 特异性自身抗体与T、B 淋巴细胞凋亡率的相关性。KOA 患者中AKA、APF、anti-CCP 表达较健康者显著上调（P<0.05）。与KOA 轻度组比较，KOA 中度患者血清中三种特异性自身抗体表达显著升高（P<0.05），KOA 重度患者极显著升高（P<0.05）。结果提示：特异性自身抗体AKA、APF 以及anti-CCP 的相对表达随着KOA 患者病情严重程度的加重呈梯度依赖性上升。KOA 中度组患者较KOA 轻度患者的T、B 淋巴细胞凋亡率显著降低（P<0.05），KOA 重度组患者极显著降低（P<0.05）。推测KOA 患者的病情程度加重与机体淋巴细胞的正常凋亡受到阻滞存在相关。ROC 诊断曲线结果表明，特异性自身抗体AKA、APF 以及anti-CCP 对于KOA 均具有良好的诊断价值。Logistic 分析显示：血清特异性自身抗体AKA、APF、anti-CCP 均是影响KOA 患者病情程度的独立危险因素（P<0.05）。相关性分析的结果表明，特异性自身抗体AKA、APF 以及anti-CCP 与T、B淋巴细胞凋亡率均呈负相关。其中AKA 与B、T 淋巴细胞负相关；APF 与B、T 淋巴细胞负相关；anti-CCP 与B、T 淋巴细胞负相关。KOA 患者血清特异性自身抗体的表达越高，淋巴细胞的凋亡率就越低。本研究对于结果的论述进行了多层次的对比以及相关数据的处理。然而，依然存在其不足之处：由于试验时间的关系，纳入的患者样本容量不够大，可能会对研究结果产生一定的影响。后续研究可扩充样本继续分析。

综上所述，KOA 患者血清特异性自身抗体的表达越高，淋巴细胞的凋亡率越低，血清特异性抗体水平与KOA 的发生密切相关，参与了KOA 的发病过程，反映了KOA 病情轻重及关节损伤程度，所以KOA 患者血清特异性表达对于KOA 的疾病诊断及病情提示都有一定的临床价值。