刘谦谦 唐梓静 李天真 李宝库 朱蕾蕾

（1. 河北大学药学院，保定 071002；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所 工业酶国家工程实验室，天津 300308）

随着现代化工行业的发展，染料在纺织厂、印染厂和造纸厂中被广泛使用［1］。今天大多使用的染料都是经还原、氧化、缩合、硝化或者磺酸化等合成得到，通常含有复杂的芳香环结构［2］。全球每年大约有8×105-9×105t不同的染料被生产，并在纺织品、皮革、纸张、塑料、化妆品和食物染色中广泛使用［3-4］。偶氮染料以一个或多个R1-N=N-R2键存在，其中偶氮染料在每年生产的染料中所占比例为60%-70%，是使用比较广泛的一类染料［5-6］。大约有90%的染料进入污水处理场，存在未处理完全的染料排放到河流中，不仅污染水质，而且破坏光线的穿透等，对水体及周边的生态系统造成危害，并威胁人类的生命健康［2，7］。利用安全、低成本的高效脱色微生物来处理染料废水变得越来越受人们关注［8］。氧化还原酶类对染料分子有破坏作用，能够达到脱色的效果。

NAD（P）H∶醌氧化还原酶1（NAD（P）H∶quinone oxidoreductase，NQO1，EC 1.6.99.2）是一种黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）依赖型蛋白，可以利用NAD（P）H作为辅因子催化包括醌类、醌亚胺类、硝基化合物和偶氮类染料等一系列底物的双电子还原［9-11］。其还原反应以乒乓机制进行，NAD（P）H和底物交替占据相同的结合位点的重叠区域，并参与双氢离子的转移，首先NAD（P）H进入活性位点还原FAD形成FADH2，然后底物进入活性位点被FADH2还原［12］。NQO1在抗氧化防御中发挥至关重要的作用，其通过还原内源性醌类如维生素E、辅酶Q10产生稳定的氢醌类化合物而发挥重要的抗氧化作用［13-14］。其次NQO1也是一个20S蛋白酶体相关的蛋白，其可以稳定肿瘤抑制因子p53、p73，从而发挥抗肿瘤作用［15-16］。同时，NQO1还能激活醌类化疗药物，成为治疗癌症的潜在药物靶点［17］。有报道称，来自大肠杆菌（E. coli）的偶氮还原酶（AzoR）和来自浑球红细菌（R. sphaeroides）的偶氮还原酶（AZR）能够催化偶氮染料的还原，且同时具有醌还原酶活性。也有研究表明，添加醌类氧化还原介质，如2-羟基-1，4-萘 醌（2-hydroxy-1，4-naphthoquinone，HNQ）、 蒽醌-2-磺酸盐（anthraquinone-2-sulfonate，AQS）、蒽醌 -2，6-二 磺 酸 盐（anthraquinone-2，6-disulfonate，AQDS）能促进偶氮染料的还原［18-19］。Cui等［20］在有氧情况下利用E. coli CD-2的全细胞，在不添加氧化还原介质条件下，只有8.5%甲基橙被脱色；而在甲萘醌存在的情况下，8 h时的脱色率达到40%以上。利用NQO1在体外进行偶氮染料的脱色研究较少。

本研究将人来源的NAD（P）H∶醌氧化还原酶（hNQO1）在大肠杆菌中成功进行异源表达，并进行蛋白纯化，考察hNQO1对3种偶氮染料刚果红和苋菜红及活性黑5的脱色研究，旨为偶氮染料的脱色及降解提供一种新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 大 肠 杆 菌E.coli BL21 Gold（DE3）pET28a-hNQO1；大肠杆菌 E.coli BL21 Gold（DE3）pET28a均由所在实验室保存。

1.1.2 主要试剂和培养基 主要试剂：酵母粉（yeast extract），胰蛋白胨（tryptone）购自英国 OXOID公司；异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-dthiogalactoside，IPTG）购自天津乐宝生物科技有限公司；BCA蛋白质浓度测定试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate），甲萘醌（menadione）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；刚果红（Congo red）购自上海源叶生物公司；苋菜红（amaranth）购自北京国纳宸宇科技有限公司；活性黑5（reactive black 5）购自Sigma Aldrich；1，4-二羟基蒽醌（1，4-Dihydroxyanthracene-9，10-dion），甲基对苯醌（2-Methlcyclohexa-2，5-diene-1，4-dione）购自上海毕得医药科技有限公司；1，4-萘醌（1，4-Naphthoquinone）购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；蒽醌（anthraquinone）购自国药集团化学试剂有限公司；蒽醌-2-磺酸钠盐（sodium anthraquinone-2-sulfonate）购自上海吉至生化科技有限公司。其他常规试剂均为国产分析纯。

LB培养基：10 g NaCl，5 g酵母粉，10 g胰蛋白胨，121℃ 20 min灭菌使用；固体培养基添加1.5%的琼脂糖。

1.1.3 主要仪器和设备 低温高速离心机；移液枪；TeCan酶标仪；摇床；微孔板振荡器；超声破碎仪等。

1.2 方法

1.2.1 菌体培养 将E. coli pET28a-hNQO1划线于LB固体平板（含50 μg/mL硫酸卡那霉素），挑单克隆接种于3 mL/管的LB培养基（含50 μg/mL硫酸卡那霉素）中，37℃，220 r/min过夜培养16-20 h。将种子液以1%接种量接种至100 mL LB液体培养基（含50 μg/mL 硫酸卡那霉素）中，37℃，220 r/min条件下培养至OD600为0.7-0.8，添加0.5 mmol/L IPTG，10℃，220 r/min，培养24 h诱导蛋白表达。4℃，4 000 r/min离心20 min，弃掉上清液收集菌体，-20℃保存备用。

1.2.2 蛋白纯化 用磷酸钠缓冲液（0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 6.2）重悬菌体，冰浴条件下超声破碎细胞，12 000 r/min离心30 min，收集上清液并于0.22 μm滤膜过滤，使用Ni Sepharose 6 Fast Flow His标签蛋白纯化填料自填装镍柱纯化。

蛋白纯化步骤：用5倍柱体积的去离子水冲洗Ni2+填充层析柱，再用5倍柱体积含有20 mmol/L咪唑的裂解缓冲液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Hepes，pH 7.0）平衡Ni2+层析柱，随即将过膜后的破碎上清加入层析柱中，使目的蛋白与层析柱充分结合；先用5倍柱体积含有20 mmol/L咪唑的裂解缓冲液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Hepes，pH 7.0）进行洗脱杂蛋白，再用5倍柱体积含有50 mmol/L咪唑的洗杂缓冲液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Hepes，pH 7.0）洗脱杂蛋白，最后用含有300 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Hepes，pH 7.0）洗脱目的蛋白得到hNQO1纯酶。利用10 kD超滤管去除咪唑并浓缩置换磷酸钠 缓 冲 液（0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 6.2），去除咪唑后，将hNQO1蛋白加入0.6 mmol/L FAD冰上孵育1 h，再使用超滤管置换缓冲溶液，并去掉表面游离的FAD，超滤结束后备用。

1.2.3 hNQO1纯化后的蛋白浓度测定 以牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）为标准蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度。

1.2.4 hNQO1热稳定的测定 用磷酸钠缓冲液将hNQO1蛋白稀释到0.165 mg/mL，取出50 μL hNQO1分别在30、35、40、50和60℃条件下加热30 min，加热完成后，冷却到室温，离心再分别加入100 μL 100 mmol/L pH 6.2磷酸钠缓冲液，以及50 μL 4 mmol/L NADH，于波长340 nm处室温下测定吸光度（反应机理：hNQO1催化NADH→NAD+，在波长340 nm处检测NADH的下降来进一步表征酶的活性）。以最高酶活为100%，计算相对酶活力。

1.2.5 不同的介体小分子对刚果红脱色影响的反应体系 在200 μL反应体系中分别加入0.07 mg/mL hNQO1纯酶，0.5 mmol/L NADH、0.2 mmol/L刚果红，0.05 mmol/L介体小分子（1，4-萘醌、蒽醌-2-磺酸钠盐、甲基对苯醌、1，4-二羟基蒽醌、蒽醌、甲萘醌），100 mmol/L pH6的Tris-HCl缓冲液。在30℃条件下反应6 h，反应0 h和6 h分别使用酶标仪在434 nm处检测吸光度值。以0 h测得的吸光度值作为起始值，计算刚果红的脱色率。

1.2.6 不同浓度的1，4-二羟基蒽醌对刚果红脱色影响的反应体系 在300 μL反应体系中分别加入0.075 U/mL hNQO1、0.5 mmol/L NADH、2 mmol/L刚果红，不同浓度的1，4-二羟基蒽醌（0.02 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L），100 mmol/L pH6的 Tris-HCl缓冲液。在30℃条件下反应2 h，取反应液20 μL加180 μL Tris-HCl缓冲液于96孔板中，使用酶标仪在434 nm处检测吸光度值，计算刚果红的脱色率。

1.2.7 hNQO1全细胞对刚果红脱色影响的反应体系 在400 μL反应体系中加入菌体密度（OD600）约为10的hNQO1全细胞或pET28a空载体全细胞，2 mmol/L刚果红，0.1 mmol/L 1，4-二羟基蒽醌，0.1 mol/L的醋酸钠作为反应缓冲液。在40℃下反应6 h，反应完成后12 000 r/min离心2 min，取出200 μL在96孔板中使用酶标仪在434 nm下检测吸光度值的变化。反应结束检测完后，去除上清溶液，加入相同浓度的上述各溶液，在同样条件下进行第二和第三次反应。

1.2.8 hNQO1全细胞对苋菜红脱色影响的反应体系 在500 μL反应体系中加入菌体密度（OD600）约为10的hNQO1全细胞或pET28a空载体全细胞，2 mmol/L苋菜红，0.1 mmol/L 1，4-二羟基蒽醌，0.1 mol/L的醋酸钠作为反应缓冲液。在40℃下反应6 h，反应完成后12 000 r/min离心5 min，取出20 μL反应液加180 μL 0.1 mol/L醋酸钠缓冲液于96孔板中使用酶标仪在520 nm处检测吸光度值的变化。

1.2.9 hNQO1全细胞对活性黑5脱色影响的反应体系 在500 μL反应体系中加入菌体密度（OD600）约为10的hNQO1全细胞或pET28a空载体全细胞，2 mmol/L活性黑5，0.1 mmol/L 1，4-二羟基蒽醌，0.1 mol/L的醋酸钠作为反应缓冲液。在40℃下反应6 h，反应完成后12 000 r/min离心5 min，取出20 μL反应液加180 μL 0.1 mol/L醋酸钠缓冲液于96孔板中使用酶标仪在596 nm处检测吸光度值的变化。

1.2.10 hNQO1对刚果红、苋菜红、活性黑5等偶氮染料脱色率的计算 以不加菌体的吸光度值为起始值，观察染料脱色的情况，根据下列公式计算脱色率。

式中：R为染料脱色率（%）；A0、A1为脱色反应前后溶液的吸光度值。

2 结果

2.1 hNQO1的表达和纯化

对E. coli BL21（DE3）pET28a-hNQO1挑取单克隆，进行诱导表达后，利用SDS-PAGE检测hNQO1蛋白的表达情况。结果如图1-A所示，在全细胞和破碎上清液中均含有目的蛋白条带，说明hNQO1经IPTG诱导后，在E.coli BL21（DE3）中能够大量地表达，蛋白质实际分子量约为30.8 kD。采用镍柱亲和层析纯化hNQO1蛋白，其SDS-PAGE结果如图1-B所示，纯酶样品在35 kD-25 kD处出现明显条带，与理论分子质量30.8 kD结果相一致。

图1 异源表达 hNQO1 的 SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of hNQO1 heterologously expressed

2.2 hNQO1热稳定的测定

将hNQO1在一系列温度下（30、35、40、50和60℃）加热30 min后，进行残余酶活测定，结果如图2所示，在30-40℃内，hNQO1较稳定，进一步升高温度，其酶活迅速下降。所以，后续实验在30℃或40℃条件下进行。

图2 热稳定性对酶活力的影响Fig. 2 Influence of thermal stability on enzyme activity

2.3 偶氮染料及醌类小分子化合物的选择

为研究hNQO1对偶氮染料的脱色作用，选择了刚果红、苋菜红及活性黑5等偶氮染料进行脱色研究（表1）。以醌类小分子化合物（表2）作为介体，辅助醌氧化还原酶对偶氮染料的脱色。介体小分子可以加速初级电子供体向终极电子受体传递，在偶氮染料的脱色过程中起到桥梁作用。具体作用机理为：醌类小分子化合物通过醌还原酶还原成氢醌，氢醌在经过纯化学作用使偶氮染料还原，实现偶氮化合物的脱色。

表1 染料名称及其最大吸收波长Table 1 Dye names and their maximum absorption wavelengths

表2 小分子介体的名称及结构Table 2 Names and structures of small molecular mediators

2.4 不同的小分子对hNQO1纯酶脱色刚果红的影响

首先选择0.05 mmol/L为介体小分子（1，4-萘醌、蒽醌-2-磺酸钠盐、甲基对苯醌、1，4-二羟基蒽醌、蒽醌、甲萘醌）在反应体系中的浓度。在反应体系中，分别添加0.05 mmol/L的上述不同的介体小分子，分别以加酶与不加酶作为对照，在30℃条件下反应6 h后，使用酶标仪在434 nm处检测吸光度的变化，记录在不同介体小分子下，hNQO1对刚果红染料的脱色情况（图3）。介体小分子为1，4-二羟基蒽醌时，hNQO1（0.07 mg/mL）对刚果红脱色率为35.5%。所以，与其它介体小分子相比，1，4-二羟基蒽醌辅助hNQO1使刚果红染料脱色效果较好。

图3 不同介体小分子对hNQO1脱色刚果红影响Fig. 3 Influence of different medium small molecules on the decolorization of hNQO1 Congo red

2.5 不同浓度的1 4-二羟基蒽醌对hNQO1纯酶脱色刚果红的影响

在上述5种介体小分子对hNQO1脱色刚果红染料的影响中，选择以1，4-二羟基蒽醌为目标在反应体系中测试其不同浓度（0.02 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L） 对脱色率的影响，在30℃条件下反应2 h，使用酶标仪在434 nm处检测吸光度的变化。如图4所示，介体小分子1，4-二羟基蒽醌在0.1 mmol/L时，hNQO1对刚果红脱色率为29.2%，脱色效果较好，随着小分子浓度的增加可能会存在析出，脱色率差别不大。因此，选择0.1 mmol/L 1，4-二羟基蒽醌进行后续试验。

2.6 重复利用hNQO1全细胞对刚果红进行脱色的研究

经过上述的研究，成功筛选出最佳的介体小分子—1，4-二羟基蒽醌。在1，4-二羟基蒽醌小分子的存在下，pET28a全细胞作为对照，与hNQO1全细胞分别对刚果红进行脱色，我们首先选择了菌体密度（OD600）为2、2.5和10进行刚果红脱色，在434 nm处检测吸光度，相比较菌体密度为10条件下最好（数据未显示）。所以，我们进一步尝试在1，4-二羟基蒽醌存在的反应体系中重复多次利用hNQO1全细胞（菌体密度为10）对偶氮染料进行脱色。如图5所示，在40℃反应6 h后，hNQO1全细胞对刚果红的脱色率为94.0%，而pET28a全细胞对刚果红的脱色率为62.6%。第一次反应结束后，离心去除上清液，二次加入刚果红及介体小分子进行脱色，再次在40℃下反应6 h发现，pET28a全细胞对刚果红的脱色率只有9.5%，而hNQO1全细胞对刚果红的脱色率为79.7%。第三次加入刚果红进行脱色，40℃条件下反应6 h后，发现pET28a全细胞对刚果红的脱色率为5.1%，hNQO1全细胞对刚果红的脱色率为20.3%。菌体3次利用的结果显示，hNQO1全细胞对刚果红的脱色效果较好。

图5 重复利用hNQO1全细胞对刚果红染料脱色的研究Fig. 5 Decolorization of Congo red dye by reusing whole cells of hNQO1

2.7 hNQO1对苋菜红及活性黑5进行脱色的研究

为进一步探究hNQO1对偶氮类染料的脱色效果，选择了其他两种染料：苋菜红、活性黑5进行脱色实验。如图6所示，在1，4-二羟基蒽醌小分子的存在下，pET28a全细胞作为对照，与hNQO1全细胞（菌体密度为10）分别对苋菜红、活性黑5进行脱色，在40℃反应6 h后，hNQO1全细胞对苋菜红染料的脱色率为18.8%，对活性黑5染料的脱色率为16.4%。

图6 hNQO1全细胞对苋菜红、活性黑5等两种偶氮染料的脱色Fig. 6 Decolorization of two azo dyes such as amaranth and reactive black 5 by whole cells of hNQO1

3 讨论

偶氮染料因分子结构含有一个或多个R1-N=N-R2键而命名，因其复杂的结构，很难利用传统的污水处理系统去降解，本研究利用NAD（P）H∶醌氧化还原酶对3种偶氮类染料（刚果红、苋菜红和活性黑5）进行脱色实验，测试不同介体小分子对脱色的影响，选出最佳介体小分子1，4-二羟基蒽醌。hNQO1全细胞对偶氮染料刚果红的脱色率最高为94.0%，且全细胞多次利用后仍存在20.3%的脱色效果。此外，初步探索了hNQO1对苋菜红、活性黑5的脱色，为偶氮类染料的脱色降解提供了一种新的思路。Hong等［21］利用AQS和ADQS作为氧化还原介体考察了Shewanella decolorationis S12对苋菜红的脱色，在8 h后脱色率75%左右。Rahman等［22］利用假单胞菌Pseudomonas euroginosa在好氧情况下对刚果红染料进行脱色，在pH 9，温度为26℃的情况下，反应5 d脱色率达87.64%。上述研究分别对偶氮染料苋菜红及刚果红进行了脱色研究发现，文献中所提到的对刚果红进行的脱色，反应5 d脱色率达87.64%，与本文中对刚果红的脱色率有所差别，本研究通过反应体系的优化最终实现hNQO1全细胞对刚果红最高为94.0%的脱色率，且hNQO1具有较好的稳定性，其全细胞多次利用后对刚果红仍有20.3%的脱色效果。

周觅等［5］在考察E.coli JM109和E.coli YB全细胞对苋菜红的脱色时，48 h脱色率为12%。Wang等［23］在一家纺织厂周围的土壤样品中分离得到Bacillus sp. YZU1菌株（具有偶氮还原酶特性）对多种活性染料具有较强脱色能力（包括偶氮染料），在40℃，pH 7.0条件下对活性黑5的脱色效果最佳。本研究初步探索了在1，4-二羟基蒽醌存在下，反应6 h后，hNQO1全细胞对苋菜红染料的脱色为18.8%，对活性黑5的脱色率为16.4%。一方面后续通过对反应体系的优化，希望能够进一步提高其脱色率；另一方面，与刚果红脱色相比，hNQO1对苋菜红、活性黑5的脱色效果不是十分明显，原因可能是苋菜红、活性黑5与刚果红在结构方面有差异，苋菜红、活性黑5等偶氮染料的脱色与苯环上的取代基的性质、位置、数量有关，甲氧基、磺酸基、硝基、甲基和羧基等基团的存在可能会使染料分子更难脱色［1］，同时，高极性取代的磺化偶氮染料较难进入胞内被还原［24］。

4 结论

本研究成功将hNQO1在大肠杆菌中异源表达，并进行蛋白纯化，通过对酶的热稳定性分析发现，其在30-40℃范围内稳定性很好。筛选了6种不同的介体小分子对hNOQ1脱色刚果红的影响发现，1，4-二羟基蒽醌具有最佳的辅助hNQO1对偶氮染料刚果红的脱色效果，hNQO1对偶氮染料苋菜红及活性黑5有微弱的脱色作用。