吴琪珍

(赣南卫生健康职业学院，江西 赣州 341000)

款冬花是菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，归肺经，主治润肺下气，止咳化痰，用于新久咳嗽，喘咳痰多，劳嗽咳血[1]。《神农本草经》称款冬花为“治嗽之最”，尤其是款冬具有甘温清补的功效，因此为临床常用止咳药物[2]。款冬花中含有萜类、酚酸类、黄酮类、生物碱类、多糖类、甾醇类等成分，其中倍半萜类成分款冬酮为《中华人民共和国药典》的含量指标性成分，目前对款冬花的成分分析研究主要集中于款冬酮和吡咯里西啶生物碱[3-4]，但对其他类型成分的含量研究较少。

款冬花中含有大量的咖啡酰奎宁酸类化合物，包括绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B与异绿原酸C等，研究[5]表明，这些化合物可显著抑制小鼠咳嗽频率，提高小鼠酚红分泌水平及抗炎效果，具有良好的止咳化痰活性。款冬花的现代炮制方法为蜜炙，蜜炙后可提高药物疗效，增强润肺止咳效果[6]。现代药理研究[7]表明，款冬花生品与蜜炙品的水提物均有一定止咳作用。HPLC指纹图谱分析研究[8]表明，绿原酸、异绿原酸A等10个化合物是款冬花生品与蜜炙品差异的主要标志物，基于NMR代谢组学技术的研究[9]发现，款冬花经过蜜炙后，绿原酸、咖啡酸等有机酸的量有所降低。此外，款冬花古代也有甘草水浸的方法。款冬花经甘草汁制后，总生物碱含量显著减少，可降低毒性[10]。

本研究通过高效液相色谱法，对款冬花中4种咖啡酰奎宁酸类化合物(绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B与异绿原酸C)进行分析，明确款冬花炮制后咖啡酰奎宁酸类化合物含量变化，并比较不同炮制方法对其的影响，以期为该类化合物的止咳活性研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪(美国Angilent公司)；CPA225D 型 1 /10 万分析天平(德国 Sartorius公司)；KQ-500E 台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

对照品绿原酸(批号：J0120AS)、异绿原酸A(批号：D1018AS)、异绿原酸B(批号：J0202AS)、异绿原酸C(批号：M1123AS)均来自美伦生物技术有限公司，甲醇为色谱纯(德国MERCK公司)，乙醇为分析纯(西陇科学)。

款冬花中药材购自安徽亳州药材市场，经赣南卫生健康职业学院吴琪珍鉴定为菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾。

2 方法与结果

2.1 款冬花炮制及浸膏制备

2.1.1 款冬花炮制 蜜款冬花：取净款冬花50 g，加入炼蜜12.5 g，润透，文火炒至不粘手，表面棕黄色，炒后蜜炙款冬花成品为50.1 g。

甘草制款冬花：取3 g甘草饮片，加水煎煮2次，合并煎液得30 mL，再加入净款冬花50 g，浸润24 h，烘箱60 ℃干燥，干燥后甘草制款冬花的成品为49.8 g。

2.1.2 款冬花浸膏制备 取款冬花生品20 g，加入6倍量体积70%乙醇，于60 ℃回流提取2 h，过滤后药材继续用5倍量体积70%乙醇回流提取1 h，重复2次，合并提取液，回收乙醇，水浴干燥，得到款冬花浸膏(KD-生品)。按同样方法，制得蜜款冬花浸膏(KD-蜜炙)与甘草汁制款冬花浸膏(KD-甘草)。

2.2 色谱条件

色谱柱Welch Ultimate XB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱温：25 ℃；流动相：0.1%甲酸(A)-甲醇(B)，流速0.8 mL/min；进样量10 μL，梯度洗脱(0～8 min，85%～75% A；8～20 min，75%～70% A；20～21 min，70%～61% A；21～30 min，61%～60% A；30～35 min，60%～52% A；35～41 min，52% A；41～45 min，52%～40% A)，检测波长326 nm。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液制备 取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B与异绿原酸C对照品适量，精密称定，置同一容量瓶中，加入50%甲醇制成浓度依次为94.0、84.8、88.8、93.2 μg/mL的混合对照品储备液。其他质量浓度的混合对照品由50%甲醇稀释对照品储备液得到。

2.3.2 供试品溶液制备 取“2.1”项下样品KD-生品15 mg置10 mL容量瓶中，精密称定，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性实验 按“2.2”项下色谱条件进行分析，4个成分理论塔板数均大于5 000，各色谱峰分离良好，分离度大于1.5。对照品溶液与供试品溶液色谱见图1。

注：1.绿原酸；2.异绿原酸B；3.异绿原酸A；4.异绿原酸C。

2.4.2 检测限与定量限 在色谱条件下，通过稀释不同浓度的混合对照品储备液得到各个化合物的检测限与定量限。见表1。

2.4.3 线性和范围考察 取混合对照品储备液，逐步稀释2倍，得到系列对照品溶液。精密吸取10 μL进样并测定峰面积，以峰面积(Y)对分析物浓度(X)作线性回归曲线，得到回归方程和相关系数。见表1。

表1 款冬花中4种分析物的线性曲线、线性范围及定量限和检测限

2.4.4 精密度试验 精密吸取同一份混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积。4种化合物的RSD值范围均在0.17%～1.75%，表明精密度良好。

2.4.5 重复性实验 精密称取KD-生品浸膏6份，按“2.3.2”制备成供试品溶液，测定峰面积，计算 4种咖啡酰奎宁酸类成分的含量，其含量RSD范围均在 0.47%～0.70%，表明方法重复性良好。

2.4.6 稳定性实验 精密吸取同一份供试品溶液10 μL，依次于0 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h进样，测定峰面积。4种化合物的RSD值范围均在0.11%～0.40%，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.4.7 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品15 mg，平行6份，分别精密加入一定量的混合对照品溶液(约1∶1)，按照“2.3.2”项下制备供试品溶液，依法进样，计算回收率。见表2。

表2 加样回收测定结果 (n=6)

2.5 样品含量测定

分别精密称取款冬花生品、蜜炙品及甘草汁制品浸膏，按“2.3.2”项制成供试品溶液，进样，测定峰面积，计算含量。见表3、图2。

表3 款冬花炮制后4种化合物的含量 (μg/mg)

图2 款冬花炮制后咖啡酰奎宁酸类化合物总含量

3 讨论

咖啡酰奎宁酸类化合物主要检测方法有高效液相色谱法、超高效液相色谱及液质联用色谱等[11]，其中HPLC简便易得，可准确对款冬花中咖啡酰奎宁酸类化合物进行定量鉴别。绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B及异绿原酸C为款冬花主要成分，其中三个异绿原酸成分为同分异构体，在加热过程中会相互异构化[12]，这为含量检测带来了一定难度。为保证检测结果准确性及样品稳定性，本次检测方法选择了先将款冬花提取物干燥，得到浸膏再进行检测。

本研究结果表明，款冬花经过炮制后，蜜炙品与甘草制品的4种咖啡酰奎宁酸类化合物含量均低于款冬花生品。从浸膏中4种成分总含量看，KD-生品(7.78%)、KD-蜜炙(4.03%)、KD-甘草(1.68%)，经过炮制后，款冬花其他成分浸提量增加，而咖啡酰奎宁酸类化合物浓度降低。从药材总含量看，款冬花蜜炙品总含量为生品的76%，甘草制品为生品的28.7%。因此，经炮制后，款冬花蜜炙品与甘草制品的含量均有下降。尤其是甘草汁浸款冬花对该类成分的影响极大，这或许影响了款冬花的止咳活性。临床也极少见到将款冬花经甘草炮制用于止咳的应用。

随着现代生产工艺的发展，款冬花传统的炮制方法也得以改良。例如，刘效栓等[13]通过正交实验法改良了款冬花蜜炙的用蜜含量和炒炙温度；宋艺君等[14-15]优化了蜜款冬花微波炮制工艺，以及甘草制款冬花的微波炮制工艺。本研究可进一步为款冬花的炮制工艺改良提供借鉴，今后还应结合款冬花的止咳药效药理研究，深入探索款冬花炮制原理及工艺优化。