陈 敏，刘博宇，阮 颖，周立平，黄 勇

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省作物表观遗传与发育重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南省教育厅植物遗传与分子生物学重点实验室，湖南 长沙 410128 ；4.汉寿县中医院，湖南 常德 415900）

接骨草（Sambucus chinensisLindl.），又名陆英、八棱麻、走马风等，是忍冬科接骨木属的高大草本或半灌木，陕西、甘肃、湖北、湖南、广东等省区均有分布。接骨草全株都可以入药，并且具有抗炎镇痛、活血化瘀等功效[1]。接骨草中含有β-谷甾醇、胡萝卜苷、绿原酸等多种化学成分[2]。其中绿原酸（Chlorogenic acid，CGA），又称咖啡单宁酸，是一种苯丙素类化合物[3]，具有抗菌[4]、降血压[5]、抗肿瘤[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]等多种药理作用，且有利于代谢性疾病的治疗[9]，是国际公认的“植物黄金”[10]。在医疗保健行业，绿原酸在银黄制剂和双黄连制剂生产过程中被用作质量控制的一个重要指标[11]。在食品行业，绿原酸广泛用于食品和果品的保鲜[12]。在日用化工行业，日本利用绿原酸及其衍生物已经研制出了抗衰老护肤品[13]。

近年来，很多研究者对杜仲、金银花等植物中绿原酸的提取工艺进行了报道，但对于接骨草中绿原酸提取工艺的报道较少。接骨草中含有较高的绿原酸含量，并且具有易于繁殖、分布广泛等特点。为了更好地开发接骨草资源，利用接骨草中的绿原酸，该研究在单因素试验的基础上，采用响应面法优化了超声波辅助提取接骨草叶中绿原酸的工艺参数，为接骨草中绿原酸的工厂化提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试接骨草栽培于湖南农业大学实验室，采摘新鲜接骨草叶片，洗净，置于45℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干，粉碎机粉碎，过40目筛备用。

1.2 试验方法

1.2.1接骨草中绿原酸提取的单因素试验精确称取接骨草粉末0.5 g，按一定液料比加入一定浓度的乙醇，超声提取一段时间，4 000 r/min离心15 min，取0.2 mL浸提液用无水乙醇定容至10 mL，待测。分别考察液料比（mL/g）20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，乙醇浓度60%、70%、80%、90%、100%，提取时间10、20、30、40、50 min对接骨草叶中绿原酸提取率的影响。

1.2.2接骨草中绿原酸提取的响应面试验通过单因素试验确定液料比（A）、乙醇浓度（B）和提取时间（C）的水平值，以接骨草叶中绿原酸的提取率（Y）为响应值，设计17组试验，每个因素的高中低水平分别以1、0、-1 编码，见表1。

表1 响应面试验的因素及水平

1.2.3绿原酸测定的波长选择采用紫外可见近红外分光光度计测定绿原酸含量。精密称取5 mg绿原酸标准品于50 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.1 mg/mL的绿原酸标准对照品溶液，取0.1 mg/mL的绿原酸标准对照品溶液0.8 mL于10 mL容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀。以无水乙醇为空白对照，在250～450 nm处进行扫描[14]，得到最大吸收波长。

1.2.4标准曲线的绘制分别吸取0.1 mg/mL的绿原酸标准对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于10 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，得到浓度为0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012、0.014、0.016 mg/mL的标准溶液。以无水乙醇为空白对照，测定其在最大吸收波长处的吸光度。以绿原酸的浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5绿原酸提取率计算精确移取0.2 mL绿原酸浸提液于10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，在最大吸收波长处测定其吸光值。根据公式（1）计算不同试验组接骨草叶中绿原酸的提取率[15]。

式中：Y为绿原酸提取率（%），C为绿原酸浓度（mg/mL），V为浸提液体积（mL），n为浸提液的稀释倍数，m为接骨草叶质量（mg）。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

用紫外可见近红外分光光度计在250～450 nm处进行扫描，测得最大吸收波长为331 nm，如图1所示。

图1 绿原酸光谱图

2.2 绿原酸测定的标准曲线

用绿原酸标准品配置不同浓度提取的绿原酸溶液，在最大吸收波长331 nm处测定吸光度值，以绿原酸标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示，得出绿原酸标准曲线方程为：y=45.9x-0.000 3，R2=0.999 5。

图2 绿原酸测定的标准曲线

2.3 单因素试验结果

2.3.1液料比从图3可以看出，液料比小于40∶1（mL/g）时，提取率随液料比的增加而增加，但液料比大于40∶1（mL/g）后，提取率随液料比的增加逐渐降低。这可能是因为当液料比小于40∶1（mL/g）时，随着提取溶剂乙醇的增加，其与接骨草叶粉末接触更加充分，有利于绿原酸的提取；当液料比大于40∶1（mL/g）时，随着提取溶剂乙醇的增加，接骨草叶中其他能溶于乙醇的物质析出，限制了绿原酸的提取。故确定40∶1（mL/g）为接骨草叶中绿原酸提取的最佳液料比。

图3 不同液料比处理下接骨草叶中绿原酸的提取率

2.3.2乙醇浓度由图4可知，乙醇浓度小于80%时，提取率随乙醇浓度的增加而增加，但乙醇浓度超过80%后，提取率逐渐降低。这可能是因为乙醇浓度较低时，接骨草叶中的绿原酸不能充分溶出，随着乙醇浓度的升高，提取率增大；但当乙醇浓度较高时，一些其他能溶于乙醇的物质快速溶出又限制了绿原酸的提取[16]。故确定80%为接骨草叶中绿原酸提取的最优乙醇浓度。

图4 不同乙醇浓度处理下接骨草叶中绿原酸的提取率

2.3.3提取时间如图5所示，提取率随提取时间的增加呈现出先增加后降低再增加的趋势。这可能是因为提取时间过短，接骨草叶中的绿原酸不能充分提取出来，而提取时间过长，会导致其他杂质的析出或者绿原酸在超声波的作用下发生聚合，使提取率降低[17]。在试验设定的条件下，提取10～50 min，绿原酸提取率在2.18%～2.33%之间，从节省能源和提高效率的角度考虑，后续试验确定提取时间为20 min。

图5 不同提取时间处理下接骨草叶中绿原酸的提取率

2.4 响应面法优化结果

2.4.1试验设计以接骨草绿原酸的提取率（Y）为考察指标，在单因素试验结果的基础上，采用Box-Benhnken设计响应面试验，使用Design-Expert（Version 8.0.6）对试验数据进行分析。响应面法试验设计和结果见表2。

表2 响应面试验设计及数据

2.4.2模型方程的建立及显著性分析以提取率Y为响应值，液料比（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）为自变量，建立的二次回归方程：Y（%）=-12.435 70+0.098 568A+0.315 52B+0.017 765C-4.525×10-4AB-2.4×10-4AC-1.15×10-4BC-6.147 5×10-4A2-1.879 75×10-3B2+7.275×10-5C2。绿原酸提取率回归模型的显著性检验见表3。

表3 回归模型及显著性检验

由表3 可知，模型的F=68.56，P＜0.000 1，说明回归模型具有统计学意义。R2=0.988 8说明模型拟合性好，R2Adj=0.974 4说明可解释97.44%相应值的变化。失拟误差P=0.779 3＞0.05，说明失拟项不显著，且变异系数为0.95%，小于1%，说明试验结果受模型外因素影响较小，可用于拟合分析[18]。液料比（A）、乙醇浓度（B）及提取时间（C）的P值均小于0.05，说明液料比（A）、乙醇浓度（B）及提取时间（C）对接骨草叶绿原酸的提取率有显著影响。而F值越大说明影响程度越大，由此可见这3个因素对绿原酸提取率的影响表现为A＞B＞C，即液料比＞乙醇浓度＞提取时间。

2.4.3响应面交互作用分析利用Design-Expert（Version 8.0.6）软件分析，得到超声波法提取绿原酸的3个因素之间交互作用的响应面图。通过曲面可以预测变量和影响值之间的相互关系，响应面越陡峭，两因素间的交互作用越显著[19]。由图6～图8可知，液料比与乙醇浓度交互作用对绿原酸提取率影响极显著（P＜0.01），乙醇浓度与提取时间交互作用对绿原酸提取率影响不显著（P＞0.05），液料比与提取时间交互作用对绿原酸提取率影响不显著（P＞0.05）。

图6 液料比和乙醇浓度对接骨草叶绿原酸提取率影响的响应面图

图7 乙醇浓度和提取时间对接骨草叶绿原酸提取率影响的响应面图

图8 液料比和提取时间对接骨草叶绿原酸提取率影响的响应面图

2.4.4结果验证经Design-Expert（Version 8.0.6）分析得出，接骨草叶提取的最佳工艺为液料比45.8∶1（mL/g）、乙醇浓度77.5%、提取时间30 min，在该工艺下接骨草叶绿原酸提取率预测值为2.347 05%。对最佳工艺进行3次验证试验，得到绿原酸的平均提取率为2.338 06%，与预测值相差很小，表明最佳工艺稳定可靠。

3 讨论与结论

超声波辅助提取法可以击碎细胞壁，使细胞内的组分充分溶出。该方法成本较低，且安全无毒、污染较小，提取过后料液容易分离，提取率相对较高[20]。李爱民等[16]曾比较过乙醇浸提法、水煮法、超声波辅助提取法和索氏提取法对接骨草叶绿原酸提取率的影响，也认为超声辅助提取法为接骨草叶中绿原酸提取的最佳方法。

该研究在单因素试验的基础上采用响应面法进一步优化，以接骨草叶中绿原酸提取率为响应值，使用响应面法共设计17组试验。通过响应面分析得到的最佳提取工艺参数为液料比45.8∶1（mL/g）、乙醇浓度77.5%、提取时间30 min，在此条件下接骨草叶绿原酸实际提取率为2.338 06%，与预测值相差很小，表明最佳工艺稳定可靠，可用于接骨草叶绿原酸提取。