刘小微,李娟娥,姜小帆,侯杰军,南晓强,李 静,刘沈楠,张洪宇,雷 鹏,雷忠义

(1.陕西省人民医院,陕西 西安 710068；2.陕西中医药大学附属医院,陕西 咸阳 712021；3.陕西省中医医院,陕西 西安 710003)

高脂血症(Hyperlipemia，HLP)是由于体内脂肪代谢异常所引起的血清中脂蛋白含量超出正常水平范围的代谢性疾病。据调查研究显示[1]：中国成人血脂异常的发病率已经从2002年的18.60%上升至2012年40.40%，出现急速上涨趋势，高脂血症是导致动脉粥样硬化性疾病的主要病因之一。近期研究证明高脂血症是遗传和环境等危险因素共同作用的结果,属于多基因性疾病[2]。

中医药治疗高脂血症的实验研究、抑制延缓动脉粥样硬化及冠心病的发生发展是多环节、多方位、多靶点的综合作用[3-4]。雷忠义国医大师在长期的临床实践中认识到痰瘀互结在冠心病的发病中是独立存在的，且贯穿于疾病整个病程中。随后经过大量的临床调查及实验研究，最终确立了冠心病痰瘀互结证型的存在，并研发了该证型目前的唯一用药——丹蒌片。该药由瓜蒌皮、薤白、丹参、黄芪、葛根、川芎、赤芍、泽泻、骨碎补、郁金等10味药物组成，具有燥湿祛痰、活血化瘀的功效[5-7]。方中瓜蒌皮与薤白为君药，起理气化痰宽胸的作用；丹参、赤芍、葛根、川芎四药合用共奏活血通络，化瘀止痛之效，黄芪补气行血，泽泻健脾利水；骨碎补补肾活血，体现了从肾治心的原则，郁金、川芎可使气血运行通畅，全方组合体现了痰瘀同治的原则，其治疗冠心病疗效确切[8-11]。在临床实践中发现丹蒌片在治疗冠心病的同时可以降低血脂水平，但是作用机制尚不完全明确。因此，本实验通过复制载脂蛋白E(Apolipoprotein E，APoE)小鼠高脂血症模型，采用现代全自动生化分析仪分析丹蒌片对血脂以及肝功指标变化的影响，采用蛋白免疫印迹法和荧光定量PCR法对肝脏中脂质代谢相关蛋白以及基因进行测定，探究丹蒌片的降脂作用以及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级6周龄APoE-/-雄性小鼠48只，体重18～22 g，由北京维通利华公司提供[许可证号:SCXK(京)2016-0006],基因遗传背景为C57BL/6。饲养于陕西省人民医院中心实验室SPF级动物房内，饲养环境为22～25 ℃，湿度为50%～60%。

1.2 药 物 丹蒌片超微粉由吉林康乃尔药业提供，国药准字Z20050244；瑞舒伐他汀钙片：阿斯利康药业，国药准字 H20160547。

1.3 试剂及仪器 抗体AMPK、SREBP-1、HMGCR均购于英国Abcam公司，抗体β-actin购于康为世纪公司，低温高速离心机(长沙英泰仪器公司)，-80 ℃冰箱(美国赛默飞世尔公司)，电泳仪、电泳槽、转膜槽(美国Bio-Rad公司)，RNA提取试剂盒产自康为世纪，逆转录试剂盒产自Biosharp，荧光定量PCR试剂盒产自Biosharp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供，见表1。

表1 PCR引物序列

1.4 分组及模型的建立 所有小鼠适应性喂养1周后，随机分为六组，空白对照组、模型组、瑞舒伐他汀钙片组、联合用药组、丹蒌片高剂量组、丹蒌片低剂量组，每组8只。空白对照组予以普通饲料喂养，其余各组予以高脂饲料喂养6周以建立高脂血症模型。6周后检测血脂发现与空白对照组相比，造模组血脂明显升高，提示造模成功。

1.5 药物治疗 根据成人每日口服药物剂量折算小鼠服药剂量，折算系数为12.33。经查阅相关文献，瑞舒伐他汀成人每日用量为10 mg，根据换算公式得出小鼠剂量大约为2 mg/kg；成人每日需服用丹蒌片4.5 g，换算成小鼠用药浓度为1 g/kg作为低剂量组，该浓度的4倍作为高剂量组，他汀临床剂量加上丹蒌片临床剂量作为联合用药组剂量。由此得出各组剂量分别为：瑞舒伐他汀组2 mg/(kg·d)、联合用药组[瑞舒伐他汀钙片2 mg/(kg·d)+丹蒌片1 g/(kg·d)]、丹蒌片低剂量组1 g/(kg·d)、丹蒌片高剂量组4 g/(kg·d)。按上述剂量将各组药物用蒸馏水制备成混悬液，每日灌胃1次 ，每次约3 ml。

1.6 指标检测

1.6.1 小鼠体重记录：一般情况每两周称量小鼠体重并记录，并观察小鼠活动度、精神状态以及皮毛光泽度。

1.6.2 血脂相关指标分析：生化指标的检测实验结束后，小鼠禁食不禁水过夜处理，摘除眼球取血，静置30 min后，以3000 r/min的速度进行离心10 min，提取上层血清，使用全自动生化仪检测血脂四项(TG、TC、LDL-C、HDL-C)及肝功能(AST、ALT)的含量。

1.6.3 通路相关分子蛋白水平测定：肝脏组织中AMPK信号通路相关分子蛋白表达水平采用Western blot法检测。取100 mg左右的小鼠肝脏组织，经蒸馏水漂洗2～3次后置于匀浆器内剪成碎块，加入1 ml的裂解液(含有10 μl蛋白酶抑制剂和10 μl磷酸酶抑制剂)继续绞碎组织；直到无明显组织块后，将其在冰上孵育30 min待其彻底裂解；4 ℃条件下10000 g转速进行离心10 min，提取蛋白上清液，并用酶标仪测定蛋白浓度。制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后在200 mA电流下将蛋白质分子转至PVDF膜上，转膜完成后的PVDF膜在含5%脱脂奶粉的封闭液中，室温孵育1 h封闭，然后孵育一抗4 ℃过夜，之后PBST洗涤数次，每次5～10 min；室温孵育二抗1 h，PBST洗涤数次，每次5～10 min。化学发光滴加ECL工作液2 min后，去尽残液，凝胶成像系统采集图像，分析数据。确定样品中 AMPK、SREBP-1、HMGCR表达的相对含量。

1.6.4 通路相关分子基因水平测定：肝脏组织中AMPK信号通路相关分子基因表达水平采用RTq-PCR法检测。采用 Trizol 试剂从肝脏中提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书反转录为cDNA，反应体系为20 μl：SYBP Green qPCR Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，无酶水7 μl，反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。PCR仪测定Ct值(扩增量达到阈值的循环数)。待测样本mRNA相对表达量的计算采用以下公式：△Ct=(待测样本mRNA Ct值)-(该样本内参 mRNA Ct值)，-△△Ct=-[待测组(Ct目的基因-Ct内参基因)-参照组(Ct目的基因-Ct内参基因)]，待测样本mRNA相对表达量=2-△△Ct。

2 结 果

2.1 高脂血症小鼠一般情况 见表2。实验进行期间模型组小鼠体重增长迅速，体型肥大，皮毛杂乱且无光泽，精神不佳；空白对照组小鼠则精神佳，皮毛顺滑有光泽，开始给药治疗后，各治疗组小鼠体重虽然仍在增长，但是速度减缓，精神好转。造模6周即给药0周时，与空白对照组相比，其他五组小鼠体重明显增加，虽然数据无统计学差异，但仍说明长期高脂饮食可以增加小鼠体重。给药6周后，与模型组比较，联合用药组和丹蒌片高剂量组小鼠体重明显降低，且具有统计学差异(P<0.05)，瑞舒伐他汀钙片组及丹蒌片低剂量组小鼠体重也降低，但无统计学差异。说明丹蒌片呈剂量依赖性降低高脂血症小鼠体重。

表2 丹蒌片对小鼠体重的影响(g)

2.2 高脂血症小鼠血脂变化 见表3。与空白对照组相比，模型组的TC，TG，LDL-C含量显著增加，具有统计学差异(P<0.001)，HDL-C含量显著降低，具有统计学差异(P<0.001)；与模型组相比，各用药组小鼠血清TC、LDL-C含量均降低(P<0.001)，瑞舒伐他汀钙片组小鼠血清TG含量显著下降(P<0.01),联合用药组小鼠血清TG含量极显著降低(P<0.001),丹蒌片低剂量组、高剂量组小鼠血清TG含量显著降低(P<0.05)；瑞舒伐他汀钙片组小鼠血清HDL含量显著升高(P<0.05),联合用药组小鼠血清HDL含量极显著升高(P<0.01)，丹蒌片低剂量组、高剂量组小鼠血清HDL含量显著升高(P<0.05)。组间比较结果显示，各用药组之间降低血清TG含量差异无统计学意义；联合用药组小鼠血清HDL含量较丹蒌片低剂量组显著升高(P<0.05)；联合用药组小鼠血清TC含量较其他三组小鼠降低(P<0.001)，丹蒌片低剂量组血清TC含量显著升高(P<0.01)，丹蒌片高剂量组小鼠血清TC含量显著升高(P<0.05)；瑞舒伐他汀钙片组小鼠较丹蒌片高剂量组小鼠的血清TC含量下降(P<0.05)，较丹蒌片低剂量小鼠的血清TC含量显著下降(P<0.01)；丹蒌片高剂量组小鼠血清TC含量较低剂量组降低(P<0.05)；联合用药组小鼠血清LDL含量较瑞舒伐他汀钙片组、丹蒌片低剂量组、丹蒌片高剂量组均显著降低(P<0.01)，与丹蒌片低剂量组比较，瑞舒伐他汀钙片组、丹蒌片高剂量组小鼠血清LDL含量显著降低(P<0.05)。说明丹蒌片具有降低血脂水平的作用，且可以和瑞舒伐他汀钙片起协同作用。

表3 各组小鼠血脂指标水平比较(mmol/L)

2.3 高脂血症小鼠肝功能变化 见表4。与空白对照组相比，模型组血清小鼠AST、ALT含量极显著升高，具有统计学差异(P<0.001)；与模型组相比，瑞舒伐他汀钙片组、丹蒌片低剂量组ALT、AST含量显著降低(P<0.05)，联合用药组、丹蒌片高剂量组ALT含量显著降低(P<0.001)；AST含量显著降低(P<0.01)，说明丹蒌片可以显著减低高脂血症小鼠肝脏中ALT、AST的含量，具有保护肝脏的作用，且与剂量成一定的正比。

表4 丹蒌片对高脂血症小鼠肝功的影响(mmol/L)

2.4 丹蒌片对高脂血症小鼠AMPK信号通路相关基因蛋白表达的影响 见图1(表5)。与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏中AMPK的蛋白表达量显著下降(P<0.05)，SREBP-1、HMGCR蛋白的表达量显著上升(P<0.01)，与模型组相比，联合用药组AMPK蛋白含量显著上升(P<0.05)，瑞舒伐他汀钙片组、丹蒌片组AMPK蛋白含量上升，差异无统计学意义。瑞舒伐他汀钙片组、丹蒌片低剂量组SREBP-1蛋白含量显著降低(P<0.05)，联合用药组、丹蒌片高剂量组SREBP-1蛋白含量显著降低(P<0.01)；与模型组相比，瑞舒伐他汀钙片组、联合用药组、丹蒌片低剂量组、丹蒌片高剂量组HMGCR蛋白含量均显著降低(P<0.05)。综上所述，丹蒌片可以通过抑制脂肪代谢相关因子SREBP-1、HMGCR蛋白水平的表达，起到降低血脂的作用。

表5 丹蒌片对AMPK信号通路相关基因蛋白表达的影响

图1 高脂血症小鼠肝脏相关基因蛋白水平免疫印迹条带图

2.5 丹蒌片对高脂血症小鼠AMPK信号通路相关基因mRNA表达的影响 见表6。与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏中AMPK mRNA表达量显著下降(P<0.001),与模型组比较，联合用药组、丹蒌片高剂量组AMPK mRNA 表达量均上升(P<0.05)；瑞舒伐他汀钙片组和丹蒌片低剂量组中AMPK mRNA表达量上升但差异无统计学意义。与空白对照组相比，模型组SREBP mRNA的表达量显著上升(P<0.05)，与模型组相比，各用药组SREBP mRNA表达量显著降低(P<0.05)。与空白对照组相比，模型组HMGCR mRNA的表达量显著上升(P<0.001)，与模型组相比，联合用药组、瑞舒伐他汀钙片组和丹蒌片高剂量组HMGCR mRNA表达量均降低(P<0.05)，丹蒌片低剂量组HMGCR mRNA表达量降低但差异无统计学意义。表明丹蒌片可以通过抑制脂肪代谢相关因子SREBP-1、HMGCR mRNA水平的表达，起到降低血脂的作用。

表6 丹蒌片对AMPK信号通路相关基因mRNA表达的影响

3 讨 论

心血管疾病仍然是造成居民死亡的首要原因，高脂血症不仅是心血管疾病的危险因素之一，而且也是动脉粥样硬化性疾病的起始因素和加重因素。中医多将高脂血症归于“痰饮”“肥胖”“消渴”“眩晕” “痰湿”等病症中，对高脂血症的这种病理状态多用“膏”“脂”“浊”进行概括[12]，属本虚标实。脾肾亏虚，无力运化，导致体内痰瘀病理产物互相胶结，阻碍血脉，是高脂血症的发病机制。高脂血症患者肥胖者居多，腹部脂肪堆积严重，因此降低脂肪合成是关键[13]。

腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activatde protein kinase,AMPK)是一种丝氨酸蛋白激酶[14]，其主要分布在肝脏、骨骼肌等能量代谢活动旺盛的组织中。它参与体内包括糖脂代谢在内的多种能量代谢过程。AMPK可以通过调节与脂代谢相关的酶及因子活性来保持体内脂代谢的平衡稳定。因此又被称为“能量代谢调节器”。固醇元件调节结合蛋白(Sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)是脂质代谢的关键调控因子，主要有三种亚型，SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2，其中SREBP-1主要参与调控胆固醇、甘油三酯和脂肪酸的合成与摄取[15]，是AMPK蛋白的重点下游调控靶点。羟甲基戊二酸单酰辅酶还原酶(Hydroxy-methylglutaryl CoA reductase，HMGCR)是胆固醇合成过程中的限速酶，其活性的表达是调控胆固醇合成的主要因素之一[16]。研究表明[17]，AMPK 可以通过抑制 HMGCR 活性，减少胆固醇的体内合成。由此可知，AMPK可直接通过对这些蛋白表达进行调节，从而调控脂质合成与分解代谢。有研究显示[18-19]，实验对胆固醇合成的控制是可以通过激活AMPK对SREBP-1和 HMGCR的调节来实现的，同时表明了在高脂饮食条件下AMPK和SREBP-1的蛋白表达是呈负相关的。因此，AMPK 活性的降低可能会使脂质沉积，导致以脂代谢异常为主的肥胖、高脂血症、脂肪肝等代谢性疾病的发生。所以，AMPK 信号通路可通过调控脂质合成来防止高脂血症的发生。有研究表明[20]高脂血症会使 AMPK 表达量下降，抑制 AMPK 信号通路及其下游靶基因使血清中 TC、TG、LDL-C指标升高，促进了高脂血症的发展。

本研究以高脂血症APoE-/-小鼠为研究对象，对丹蒌片通过影响AMPK/SREBP信号通路降低血脂的作用及机制进行了深入的研究。与空白对照组相比，模型组血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST含量显著升高，HDL-C含量显著降低，肝脏组织中AMPK基因及蛋白水平表达量明显下降，SREBP-1、HMGCR基因及蛋白水平表达量显著升高；与模型组相比，给药组血清中TG、TC、LDL-C、AST、ALT含量显著下降，HDL-C含量显著升高，肝脏组织中AMPK基因及蛋白水平表达量明显上升，SREBP-1、HMGCR蛋白含量显著降低；各治疗组组间比较，降低TC、LDL-C的作用效果联合用药组>瑞舒伐他汀钙片组>丹蒌片高剂量组>丹蒌片低剂量组；降低TG和升高HDL-C的效果各治疗组之间无统计学差异，降低ALT的效果联合用药组和丹蒌片高剂量组优于瑞舒伐他汀钙片组和丹蒌片低剂量组。

综上所述，丹蒌片可以降低高脂血症小鼠的血脂水平，可能与激活AMPK信号通路，抑制脂质合成相关基因表达有关。本研究为中成药丹蒌片在治疗高脂血症方面提供新的有力证据和一定的创新思路。然而，丹蒌片体内降血脂效果如何尚需进一步探索。