王春霞　何亚萍　李陈浩　曾郅隆　杨建强　马含月　魏春华　张显

摘    要：为构建西瓜突变体库并创制优异突变新材料，以西瓜种质M08为试材，设置6个甲基磺酸乙酯（EMS）浓度（φ）（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）和3个诱变时间（12 h、18 h和24 h）的处理组合，根据相对成苗率来筛选最佳EMS诱变条件。结果表明，西瓜种质M08对EMS具有较强耐受性;M1代出苗率和成苗率均随着EMS浓度的升高和诱变时间的延长呈下降趋势。为了获得较大的突变群体，同时保证一定的诱变率，最终采用开壳后温汤浸种4 h，相对成苗率接近半致死剂量的1.5% EMS浸种12 h 或者1.0% EMS浸种24 h的处理组合，作为西瓜种质M08 EMS诱变的最佳条件，研究结果为下一步构建西瓜突变体库和通过诱变创制西瓜新材料奠定基础。

关键词：西瓜;种子;EMS诱变;相对成苗率

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）10-026-06

Optimation of EMS mutation in watermelon germplasm M08

WANG Chunxia1， HE Yaping1， LI Chenhao1， ZENG Zhilong1， YANG Jianqiang1， MA Hanyue2， WEI Chunhua1， ZHANG Xian1

（1. College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. Dongtai National Modern Agricultural Industrial Park， Dongtai 224200， Jiangsu， China）

Abstract： In order to construct watermelon mutant library and create new mutant materials， six EMS concentrations （0， 0.5%， 1.0%， 1.5%， 2.0%， and 2.5%） and three treatment times （12 h， 18 h and 24 h） were combined to screen the best EMS mutation condition according to the seedling relative growth rate. The results showed that the watermelon germplasm M08 had a strong tolerance to EMS， and the germination rate of all treatments were higher than 60%. Both the emergence and seedling rates of M1 generation were affected by EMS treatment， which showed similar downward trends corresponding to the increase of EMS concentration and the extension of mutation time. In order to obtain a large mutagenesis population and ensure a high mutation rate， the following condition was preferentially selected as the best EMS mutation condition for watermelon germplasm M08： After soaking for 4 h in warm water， the seeds without coats were treated with 1.5% EMS for 12 h or with 1.0% EMS for 24 h， of which the relative seedling rates were close to the median lethal dose. The present results  provide a theoretical reference for construction of watermelon mutagenesis libraryandcreate new materials by EMS treatment.

Key words： Watermelon; Seed; EMS mutation; Relative seedling growth rate

西瓜（Citrullus lanatus L.）为葫芦科西瓜属一年生草本蔓生植物，原产于非洲，经驯化后成为了可食用的西瓜。我国是西瓜生产和消费的第一大国，目前收集保存的西瓜种质资源有1500份左右[1]。自20世纪50年代以来，经过育种工作者的不断努力，我国的西瓜品种已经实现了至少5次更新换代，极大地推动了我国西瓜产业的发展。然而，长期的人工选择育种导致现有的西瓜遗传基础狭窄，使得部分优良性状丢失（如抗性基因等），明显影响了西瓜品种的多样化选育进程[2]。因此，利用诱变技术创制新的育种材料，可以有效地解决这一问题，同时对拓宽遗传背景、深度挖掘重要功能基因也具有重要作用[3-4]。

甲基磺酸乙酯（EMS）因其具有诱变突变率高、诱变效果好、成本低、易操作、突变范围广、不易产生染色体畸变等特点而成为应用最广泛的化学诱变剂[5-11]。目前，已有多种作物通过EMS实现了种质创新和新品种选育，如大麦[12]、大豆[13-14]、花生[15-17]、绿豆[18]以及番茄[19-20]等。最近10年，才有关于葫芦科作物利用EMS构建突变体库的研究报道，甜瓜[21]是最早利用EMS创建突变体库的，筛选出的突变体不仅能够创制新的育种材料，还可为基因功能解析提供珍贵资源，加速其分子研究进程，如Galpaz等[22]利用EMS诱变技术成功获得甜瓜橙黄色瓜瓤突变体，并克隆类胡萝卜素异构酶基因yofI。种子是EMS诱变处理最常用的材料，其优点在于操作简单、便于大量处理，而且无需设备仪器便可以在短时间内构建大量的突变群体。刘忠松等[23]通过对多种作物种子的EMS诱变条件进行探索分析，发现多数作物种子的适宜EMS诱变浓度在0.3%～1.5%之间，诱变时间以不超过24 h为宜。如在葫芦科作物中，王学征等[24]认为1.0%浓度的EMS浸泡9 h为西瓜W1-17的最佳诱变条件，然后对M1和M2代群体进行表型观察，成功地构建了西瓜突变体库。康宝珊等[25]研究发现瓠瓜种子开壳后有助于提高种子对EMS的敏感性，最终采用开壳浸种4 h，1.5%浓度的EMS处理8 h为瓠瓜种子诱变的最适宜条件。弭宝彬等[26]研究了處理浓度和处理时间对冬瓜种子萌发和生长的影响，表明冬瓜种子最佳诱变条件为1.2%EMS诱变处理12 h，依此成功构建了冬瓜突变体库。Chen等[27]认为黄瓜品系406的最佳诱变条件为1.5%的EMS，处理12 h。程蛟文等[28]首次以苦瓜干种子为材料，明确了清水浸种8 h后，用1.5% 或者1.2%的EMS溶液处理2 h是苦瓜EMS诱变的适宜条件。

本研究以西北农林科技大学园艺学院西甜瓜课题组的核心种质M08为试验材料，该种质具有优异的农艺性状和良好的抗逆性，如高抗枯萎病、兼抗炭疽病，以及良好的抗旱性等[29-31];现已应用于课题组多个品种的选育，如西农8号、农科大6号和农科大11号等[32-33]。EMS处理种子后可诱变产生高密度的点突变，无外源基因渗入，其优异突变材料可直接用于遗传育种中。通过设置不同的EMS溶液浓度和不同诱变时间的处理组合，统计和分析各处理组合对种子发芽率、相对出苗率、相对成苗率的影响，同时对处理获得的西瓜幼苗进行田间农艺性状观察，确定西瓜种质M08 的EMS诱变适宜条件，旨在为下一步构建西瓜突变体库以及创制西瓜新种质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西瓜种质M08由西北农林科技大学园艺学院西甜瓜课题组提供，该种质果肉质地脆细、瓤色深红，口感极佳，且具高产潜力。EMS（甲基磺酸乙酯）原液购自Sigma-Aldrich公司（货号：M0880），为无色溶液，用0.2 mol·L-1的磷酸缓冲液（pH 7.0）为溶剂，按照体积分数配制不同浓度的EMS溶液[24]。EMS诱变试验于2020年5月在西北农林科技大学园艺学院蛋白分析实验室进行，诱变材料筛选在杨凌揉谷镇权家寨西甜瓜试验基地进行，于2020年11月结束。

1.2 方法

设置6个EMS浓度梯度（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）和3个诱变时间（12 h、18 h、24 h），共18个处理组合，并以磷酸缓冲液为对照。每个处理50粒，重复3次。具体操作流程为：选取西瓜种质M08的饱满种子，嗑开其种脐部位，温汤浸种4 h，用吸水纸将种子表面水分吸干后，置于50 mL离心管内，在通风橱中加入20 mL EMS溶液，在摇床上分别震荡处理12 h、18 h和24 h，全程用黑色塑料袋遮光（EMS見光易分解）;处理结束后，采用硫代硫酸钠溶液作为反应终止剂，使用1 mol·L-1硫代硫酸钠（Na2S2O3）洗1次后，再使用100 mmol· L-1硫代硫酸钠（Na2S2O3）洗2次，每次洗5 min;将各处理的种子做好标记后装于纱网袋中，流水冲洗5～6 h，沥干水分后，用湿毛巾包裹装于塑封袋内，置于28 ℃暗培养箱内催芽。每隔24 h观察并记录种子发芽情况，以对照组全部发芽的当天（第3天）作为最终统计发芽率的时间。

随后将发芽种子播于科研温室的50孔穴盘中，待种子萌发后，统计各处理的出苗数，播种后第20 天计算各处理的相对出苗率，第40 天统计各处理的成苗情况并计算成苗率以及相对成苗率，成苗的标准是植株具有生长点及2片以上真叶。相关指标计算公式如下：

发芽率/%=（发芽总数/供试种子数）×100;

出苗率/%=（出苗总数/供试种子数）×100;

相对出苗率/%=（出苗率/对照出苗率）×100;

成苗率/%=（成苗总数/供试种子数）×100;

相对成苗率/%=（成苗率/对照成苗率）×100。

于2020年8月16日，将诱变处理获得的全部幼苗在3叶1心时定植于杨凌区揉谷镇权家寨西甜瓜试验基地的日光温室中，采用宽垄种植，膜下滴灌及吊蔓栽培的形式，种植垄宽70 cm，植株双行定植于种植垄上，垄沟宽50 cm，沟深15 cm，株行距均为50 cm，每垄40株;定期观察植株的田间表型，筛选变异植株。

1.3 数据分析

采用SPSS19.0软件进行方差分析，并采用Duncan检验确定各处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同处理组合对种子发芽率的影响

由表1可知，在相同的诱变时间内，种子的发芽率随着浓度的升高而逐渐降低。EMS浸种处理12 h，仅在浓度为2.5%时发芽率才显著低于对照，其余处理间无显著差异，且发芽率仍在90%以上，表明EMS浸种处理12 h对种子发芽率抑制作用弱。当EMS浓度大于1.0%、浸种时间为18 h和24 h时，抑制作用变得显著;如浸种处理18 h时，与对照相比，浓度为1.5%、2.0%和2.5% 的发芽率分别降低了18.00%、20.00%和24.67%。

在相同的EMS浓度处理条件下，种子的发芽率随着时间的延长而逐渐降低。浓度分别为1.0%、1.5%、2.0%时，浸种处理24 h的发芽率比浸种处理12 h的发芽率分别下降了8.85%、19.17%、23.45%;浓度为2.5%、浸种处理24 h时，发芽率仅为60.00%，相比于处理12 h、18 h分别降低了35.71%、20.35%。浓度由1.0%升到1.5%，浸种处理18 h和24 h的发芽率均出现大幅降低的现象，这表明M08种质对EMS具有一定耐受性，经高浓度的EMS处理才会对其发芽率产生较为明显的抑制作用。

综上所述，EMS溶液浓度和诱变时间都会对西瓜种子发芽率产生影响，当浓度相同时，种子的发芽率会随着时间的延长而降低;当浸种时间相同时，种子的发芽率会随着浓度的升高而降低。然而，相比于已有研究文献[24]，本试验中采用的最高浓度和时间均远高于他人试验中所采用的，但是发芽率仍未降至50%以下，这表明种质M08对EMS具有较强的耐受性。

2.2 不同处理组合对相对出苗率和相对成苗率的影响

由表2可知，EMS处理对种子M08的相对出苗率和相对成苗率有较大影响，且相对出苗率与相对成苗率的变化趋势一致，均随着EMS浓度升高和诱变时间延长呈下降的趋势。试验结果表明，当浓度为0.5%时，诱变处理12、18和24 h的相对出苗率与对照差异不显著;当EMS浓度为1.0%时，18和24 h的相对出苗率与对照差异显著，而12 h不显著;当浓度大于1.0%时，3个处理时间的相对出苗率与对照均有显著差异，且相对出苗率均大于50.00%，比如浓度为2.5%时，诱变处理12、18和24 h的相对出苗率分别为75.19%、59.72%、58.25%。试验结果表明诱变浓度和处理时间都会影响种子的相对出苗率，当浓度一定时，随诱变时间的增加，种子的相对出苗率呈逐渐降低的趋势;当诱变时间一定时，种子的相对出苗率也会随着时间的延长而逐渐降低。

试验结果表明，EMS处理对M08种子的相对成苗率影响较大，各处理组合的相对成苗率均显著低于对照。当诱变时间为24 h时，0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%浓度的EMS处理后种子的相对成苗率分别为71.31%、51.16%、40.31%、37.98%和23.25%，相比于诱变处理12 h时的相对成苗率，分别降低了20.68%、15.95%、21.65%、21.77%和37.09%;由此可以得出，EMS浓度的升高和诱变时间的延长都会导致种子的相对成苗率降低，且高浓度、长时间的处理组合还会对幼苗的生长造成严重的影响。

为获得较大的突变群体和保证一定的变异率，在本研究中将相对成苗率的半致死剂量作为筛选标准[24]。其中，12 h、1.5%EMS处理组合的相对成苗率为51.45%，24 h、1.0%EMS处理组合的相对成苗率为51.16%，均接近半致死剂量。所以确定种子开壳后温汤浸种4 h，然后采用1.5%的EMS浸种处理12 h或者1.0%的EMS浸种处理24 h为西瓜种质M08较适的诱变处理条件。

2.3 不同诱变处理组合对M1代植株农艺性状的影响

苗期调查结果显示（图1），相比于对照，M1植株的长势明显较弱，主要表现为开花晚、植株矮小、叶片畸形等。经EMS处理过的大部分植株在生长初期出现了不同程度的真叶皱缩或叶片不伸展等现象（图1-F），而且这些植株在生长后期均表现出矮化的症状，这可能是与叶片面积小、光合作用弱有关;此外，还出现了子叶连结（图1-B）、子叶翅状（图1-C）、3片子叶且无生长点（图1-D）等现象，这些幼苗在后期的生长过程中个别叶片呈现畸形或死亡，表明EMS会使植物发生生理性损伤;还出现了嵌合体叶（图1-G），但在后期的生长发育过程中会逐渐恢复;在观察中发现叶形变异也较多，其中如植株整株叶片变狭长、裂刻变深（图1-H）;茎之间出现粘连、并生的现象（图1-I）;以及叶片的着生方式由互生变为轮生，连续3个节位以上每个节位上开2～3朵花（图1-J）;变异还会表现在花器官上，正常的雄花和雌花的花瓣数为5（图1-K），而变异的雄花花瓣数3～9枚不等（图1-L～O），变异的雌花花瓣数为3枚（图1-P）。

3 讨论与结论

本试验设置6个EMS浓度和3个诱变时间共18个组合来处理M08种子，种子的发芽率随着EMS浓度的升高和诱变时间的延长而显著降低，表明EMS能够抑制种子的萌发。此前，在西瓜种子[24]和冬瓜种子[26]的诱变处理试验中，均认为EMS溶液浓度比诱变处理时间对种子的发芽率影响更大，就本试验的发芽率指标来看，诱变处理时间与EMS溶液浓度都会对种子的发芽率产生较大的影响，浸种处理12 h时，0～2.5%浓度的发芽率仍可达90%以上，说明EMS浓度对种子发芽率有影响，但抑制作用较弱;而当浸种时间延长至24 h时，浓度大于1.0%时，抑制作用逐渐显著，当溶液浓度为2.5%时，发芽率仅有60.00%，说明随着浓度的增加，浸种时间对种子发芽率的抑制作用越明显[34]。西瓜种质M08对EMS有较强的耐受性，只有EMS的溶液浓度增加到1.5%以上时，才对各生理指标的抑制效果变得显著，发芽率、相对出苗率和相对成苗率均呈现出一致的变化趋势，都是随着EMS浓度的升高和诱变时间的延长呈下降的趋势，这与温日宇等[35]、吴思远等[36]的研究结果一致。利用EMS诱变技术构建突变体库，是创制新种质、选育新品种的重要手段，因此确定适宜的诱变条件尤为关键。通常认为，诱变处理的原则是既能产生较多的变异，同时又不致严重地损伤材料。为了获得一定量的突变群体，通常把诱变处理后50%植株存活的剂量即半致死剂量作为选择依据[37]。对于植株存活的定义，前人均有不同见解，叶卫君等[18]、康宝珊等[25]和程蛟文等[28]将发芽率或相对发芽率作为半致死剂量，但这可能会使得最终获得的突变群體较小。而Vicente-Dólera等[38]为了收获到较多的可育株，将花粉活力作为半致死剂量来确定最佳的诱变剂量，但此标准会遗漏一些突变体。因此，笔者在本研究中综合考虑了后代的变异率和成活率，将幼苗具有生长点及2片以上真叶作为植株成苗的依据，以相对成苗率的半致死剂量来确定诱变的最佳条件。

综上，通过研究不同EMS浓度和诱变时间组合处理对西瓜种子发芽率、相对出苗率和相对成苗率的影响以及对植株表型的观察，确定了开壳后先温汤浸种4 h，然后用1.5%的EMS浸泡12 h或1.0% EMS浸泡24 h的处理组合为西瓜种质M08诱变处理的最适条件。研究结果为下一步利用EMS诱变技术开展西瓜诱变育种相关研究提供了重要参考。

参考文献

[1] 马双武，刘君璞，王吉明，等.西瓜种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社，2015.

[2] 刘文革，何楠，赵胜杰，等.我国西瓜品种选育研究进展[J].中国瓜菜，2016，29（1）：1-7.

[3] GREENE E A，CODOMO C A，TAYLOR N E，et al.Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis[J].Genetics，2003，164：731-740.

[4] 郝爱平，詹亚光，尚洁.诱变技术在植物育种中的研究新进展[J].生物技术通报，2004（6）：30-34.

[5] 齐晓花，李倩倩，叶思佳，等.黄瓜EMS诱变突变体库的构建[J].分子植物育种，2019，17（18）：6066-6072.

[6] 张瑞成，李魏，潘素君，等.化学诱变在种质资源改良上的应用[J].分子植物育种，2017，15（12）：5189-5196.

[7] 刘翔.EMS诱变技术在植物育种中的研究进展[J].激光生物学报，2014，23（3）：197-201.

[8] 崔清志，刘晓红，陈惠明.EMS诱变育种研究进展[J].湖南农业科学，2013（5）：7-9.

[9] 臧辉，任卫波.EMS诱变在植物育种中的研究与应用[J].分子植物育种，2018，16（17）：5782-5788.

[10] 李雪平，金珂，张向军.化学诱变剂诱变植物的研究进展[J].现代农业，2019（2）：38-39.

[11] 董颖苹，连勇，何庆才，等.植物化学诱变技术在育种中的运用及其进展Ⅰ. 化学诱变技术及诱变效率[J].种子，2005（7）：54-58.

[12] 栾海业，徐肖，陶红，等.大麦EMS突变体库构建和突变体筛选[J].麦类作物学报，2020，40（5）：577-584.

[13] 薛永国，刘鑫磊，唐晓飞，等.东北春大豆60Co-γ辐射和EMS诱变的突变特点分析[J].大豆科学，2020，39（12）： 174-182.

[14] 降云峰，刘永忠，李万星，等.甲基磺酸乙酯诱变技术在大豆育种上的应用[J].园艺与种苗，2012（6）：12-15.

[15] 侯蕾，付春，夏晗，等.花生突變体的诱导与筛选利用[J].山东农业科学，2016，48（1）：11-15.

[16] 许燕，谢永平，郑楚群，等.EMS诱变花生珍珠1号创制优良新种质[J].核农学报，2020，34（7）：1369-1377.

[17] 杨富军，王绍伦，高华援，等.不同基因型花生EMS诱变条件分析及突变系筛选[J].安徽农业科学，2014，42（33）：11778-11781.

[18] 叶卫军，杨勇，张丽亚，等.绿豆EMS诱变突变体库的构建及表型分析[J].中国农学报，2020，36（17）：36-41.

[19] 尚娜.EMS诱变番茄突变体库的构建及表型分析[D].哈尔滨：东北农业大学，2017.

[20] 崔霞，梁燕，王玲慧.不同浓度化学诱变剂甲基磺酸乙酯对番茄种子发芽的影响[J].北方园艺，2013（14）：28-30.

[21] GONZ?LEZ M，XU M，ESTERAS C，et al.Towards a TILLING platform for functional genomics in Piel de Sapo melons[J].BMC Research Notes，2011，4（1）：289.

[22] GALPAZ N，BURGER Y，LAVEE T，et al.Genetic and chemical characterization of an EMS induced mutation in Cucumis melo CRTISO gene[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，2013，539（2）：117-125.

[23] 刘忠松，罗赫荣.现代植物育种学[M].北京：科学出版社.2010.

[24] 王学征，朱娜娜，高清宇，等.EMS诱变西瓜种子条件分析[J].东北农业大学学报，2015，46（7）：35-39.

[25] 康保珊，李俊香，刘丽锋，等.甲基磺酸乙酯诱变瓠瓜种子的条件筛选[J].中国瓜菜，2017，30（2）：7-10.

[26] 弭宝彬，谢玲玲，王鑫，等.冬瓜EMS诱变条件优化及突变体筛选[J].中国农学通报，2018，34（21）：35-41.

[27] CHEN C，CUI Q Z，HUANG S W，et al.An EMS mutant library for cucumber[J].Journal of Integrative Agriculture，2018，17（7）：1612-1619.

[28] 程蛟文，钟建，程雨柔，等.苦瓜种子EMS诱变条件分析[J].中国蔬菜，2019（1）：26-31.

[29] 赵银平.32份西瓜种质资源和品种对枯萎病抗性鉴定及综合评价[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2016.

[30] 罗婷.西瓜苗期炭疽病抗性鉴定方法及其抗病机理研究[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2008.

[31] 李聪.西瓜种质资源苗期抗旱性鉴定研究[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2012.

[32] 马建祥，张显，张勇，等.西瓜新品种陕农6号的选育[J].中国蔬菜，2016（5）：66-68.

[33] 张勇，马建祥，张显.高抗枯萎病西瓜新品种‘农科大11号[J].园艺学报，2016，43（1）：199-200.

[34] 刘威，杨峰，任旭东，等.EMS对种子萌发影响的进展[J].分子植物育种，2017，15（11）：4585-4589.

[35] 温日宇，郭耀东，刘建霞，等.不同浓度EMS对甜荞种子发芽的影响[J].陕西农业科学，2015（1）：12-13.

[36] 吴思远，吴根堃，王朋月，等.不同甲基磺酸乙酯（EMS）浓度对芥蓝种子萌发及种苗生长的影响[J]北方园艺，2018（21）：72-75.

[37] 崔霞，梁燕，李翠，等.化学诱变及其在蔬菜育种中的应用[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2013，41（3）：205-212.

[38] VICENTE-DOLERA N，PINILLOS V，MOYA M，et al.An improved method to obtain novel mutants in Cucurbita pepo by pollen viability[J].Scientia Horticulturae，2014（169）：14-19.