王维学，樊小群，丰景斌，符仲秋，陈希跃

（海南省三亚市人民医院 1.创伤骨科；2.检验科，三亚 572000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是常见的自身免疫性慢性关节疾病，其滑膜组织异常增生和滑膜炎症是常见的病理现象，具有极高的致残率[1-2]。滑膜成纤维细胞是RA 的主效应细胞，其细胞增殖、凋亡和炎症浸润等与RA 发病机制较为密切，严重可导致关节畸形和功能障碍[3-4]。miRNA是一类长度约为18～22核苷酸的非编码RNA分子，在进化上具有高度保守的特性，越来越多的研究表明，miRNA 可以作为RA 的诊断标记物和治疗靶标[5-6]。有研究结果显示，miR-106a-5p在RA患者的多克隆Vγ9Vδ2T 细胞中低表达[7]，但是具体机制尚不清楚。Toll样受体4（TLR4）是免疫系统的病原微生物的主要受体，Li 等[8]研究结果显示，TLR4 在类风湿骨关节中高表达，miR-506通过下调TLR4抑制成纤维样滑膜细胞的增殖并促进其细胞凋亡。本研究通过体外培养滑膜成纤维细胞MH7A，探讨miR-106a-5p 对RA 滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响，以及是否可能与TLR4 相关，旨在为RA 提供新的潜在治疗标志物。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

RA滑膜成纤维细胞MH7A购买于广州吉尼欧生物公司；胎牛血清、DMEM 高糖培养基购买于Gibco 公司；miR-NC、miR-106a-5p、si-NC、si-TLR4、anti-miR-NC、anti-miR-106a-5p、pcDNA 和TLR4 购买于广州锐博生物公司；Lipofectamine 2000 试剂盒、TRIzol 试剂盒、反转录试剂盒购买于Introvigen公司；Fast SYBR Green Master Mix试剂盒和引物购买上海吉玛公司；TLR4抗体、PCNA抗体、Bax抗体和Bcl-2 抗体购买于Cell Signal Technology 公司；MTT试剂盒购买于上海碧云天生物；凋亡试剂盒购买于上海贝博生物公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购买于Promega公司。

1.2 样本收集

本研究中22例RA滑膜组织取自海南省三亚市人民医院类风湿关节炎患者进行膝关节置换手术或切除膝关节滑膜组织，其中男13例，女9例，年龄45～85 岁，平均（62.1±9.8）岁；同时，收集22 例非类风湿关节炎患者在本院接受膝关节损伤或十字韧带断裂接受手术的患者作为对照组（均无急性或慢性关节异常的病史），其中男15例，女7例，年龄43～82岁，平均（61.5±11.3）岁。所有患者在手术前均签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.3 细胞培养与转染

取出冷冻保存滑膜成纤维细胞MH7A，复苏后在培养箱内设置为37 ℃、5%CO2进行培养，滑膜成纤维细胞MH7A接种至完全培养基内（10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基），待细胞贴壁生长至85%时，加入胰蛋白酶消化传代培养。

取对数生长期的滑膜成纤维细胞MH7A，每孔按照1×106/孔接种至6 孔板中，将细胞分为8 组：miR-NC 组（转染miR-NC）、miR-106a-5p 组（转染miR-106a-5p）、si-NC组（转染si-NC）、si-TLR4组（转染si-TLR4）、anti-miR-NC 组（转染anti-miR-NC）、anti-miR-106a-5p 组（转染anti-miR-106a-5p）、miR-106a-5p+pcDNA组（共转染miR-106a-5p和pcDNA）以及miR-106a-5p+TLR4组（共转染miR-106a-5p和TLR4），转染步骤按照Lipofectamine 2000说明书进行。

1.4 qRT-PCR检测检测miR-106a-5p和TLR4 mRNA的表达

采用TRIzol 试剂盒提取各组滑膜成纤维细胞MH7A 的总RNA，检测RNA 浓度和纯度后经反转录试剂盒反转录为cDNA 模板，参照Fast SYBR Green Master Mix 试剂盒说明书，以U6 和GAPDH作为内参，通过2-ΔΔCt公式计算miR-106a-5p和TLR4 mRNA的表达。

1.5 Western blotting检测TLR4、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表达

取对数生长期的滑膜成纤维细胞MH7A 用于提取总蛋白，加入蛋白裂解液冰上裂解20 min，离心后收集细胞上清。BCA 法定量检测蛋白，在SDSPAGE 处理上样的蛋白样品，然后将处理过的蛋白样品转膜，加入脱脂奶粉室温下封闭培养2 h，加入TLR4、PCNA、Bax和Bcl-2抗体，4 ℃过夜培养，加入二抗，室温培养2 h，滴加化学发光液显影，采用Image J分析目的蛋白。

1.6 MTT检测细胞增殖

取对数生长期的滑膜成纤维细胞MH7A，调整细胞密度为5×104个/mL 并接种在96 孔细胞板内，在培养箱内孵育48 h、72 h 时，按照MTT 试剂盒说明书，每孔加入5 mg/mL 的MTT，继续培养4 h，每孔内继续加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），然后在酶标仪570 nm处检测每孔的吸光度值。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期的滑膜成纤维细胞MH7A，调整细胞密度1×106/mL，然后加入400 μL 1×磷酸盐结合缓冲液，随后按照凋亡试剂盒说明书，加入相应的Annexin V-FITC和PI染色液，轻轻混匀在避光处反应15 min，1 h内在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.8 双荧光素酶报告实验验证miR-106a-5p 和TLR4靶向关系

构建miR-106a-5p结合位点的TLR4 3’-UTR野生型荧光素酶载体（TLR4-WT）和突变型荧光素酶载体（TLR4-MUT），然后采用Lipofectamine 2000与miR-NC 或miR-106a-5p 共转染，培养48 h 后，收集滑膜成纤维细胞MH7A，采用双荧光素酶报告试剂盒检测荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据分析，计量资料以平均数±标准差（）表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验；两组均数比较采用t检验；P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-106a-5p 和TLR4 在类风湿滑膜组织中的表达

与对照组相比，RA滑膜组织中miR-106a-5p表达明显降低（P＜0.05），TLR4 mRNA 和蛋白表达明显增加（均P＜0.05），见图1。

图1 miR-106a-5p和TLR4在RA滑膜组织中的表达

2.2 过表达miR-106a-5p对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

与miR-NC 组 相 比，miR-106a-5p 组 的miR-106a-5p表达、细胞凋亡率和Bax蛋白表达明显增加（均P＜0.05）；48 h 及72 h 的细胞OD 值、PCNA 和Bcl-2蛋白表达明显降低（均P＜0.05），见图2和表1。

表1 过表达miR-106a-5p对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

表1 过表达miR-106a-5p对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

图2 过表达miR-106a-5p对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

2.3 干扰TLR4 对滑膜成纤维细胞MH7A 增殖和凋亡的影响

与si-NC 组相比，si-TLR4 组的TLR4 mRNA 及蛋白表达、48 h及72 h的细胞OD值、PCNA和Bcl-2蛋白表达明显降低（均P＜0.05）；细胞凋亡率和Bax蛋白表达明显增加（均P＜0.05），见图3和表2。

表2 干扰TLR4对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

表2 干扰TLR4对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

图3 干扰TLR4对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

2.4 miR-106a-5p靶向TLR4的表达

通过Starbase 在线数据库预测显示,miR-106a-5p 和TLR4 存在互补的核苷酸序列，见图4A。与miR-NC 组相比，miR-106a-5p 组的TLR4-WT 荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），而TLR4-MUT 荧光素酶素酶活性无明显变化，见图5。与anti-miR-NC组相比，anti-miR-106a-5p 组中miR-106a-5p 表达明显降低（P＜0.05），TLR4 蛋白表达明显增加（P＜0.05），见图4B和表3。

表3 miR-106a-5p靶向TLR4的表达

表3 miR-106a-5p靶向TLR4的表达

图4 miR-106a-5p靶向TLR4的表达

图5 双荧光素酶报告实验

2.5 过表达TLR4 可以逆转过表达miR-106a-5p 对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

与miR-106a-5p+pcDNA组相比，miR-106a-5p+TLR4组的TLR4 mRNA及蛋白表达、48 h及72 h的细胞OD 值、PCNA 和Bcl-2 蛋白表达明显增加（均P＜0.05）；细胞凋亡率和Bax蛋白表达明显降低（均P＜0.05），见图6和表4。

图6 过表达TLR4可以逆转过表达miR-106a-5p对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

表4 过表达TLR4可以逆转过表达miR-106a-5p对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

表4 过表达TLR4可以逆转过表达miR-106a-5p对滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响

3 讨论

miRNA 在RA 中差异表达，通过参与细胞的增殖、凋亡等发挥作用，如miR-6089在RA滑膜组织和成纤维样滑膜细胞中低表达，上调miR-6089的表达明显抑制成纤维样滑膜细胞的增殖，并促进了细胞凋亡，miR-6089 通过调控CCR4 调控RA 的增殖和凋亡[9]。Li等[10]研究结果显示，miR-192在滑膜组织中的表达明显低于健康对照，过表达miR-192 可以明显抑制成纤维样滑膜细胞的增殖，使细胞周期阻滞，促进细胞的凋亡。Huang等[11]研究结果显示，通过微阵列分析筛选发现miR-26a-5p 在成纤维滑膜细胞中表达发生改变，且通过荧光定量PCR 验证，结果显示，miR-26a-5p 在成纤维样滑膜细胞中高表达，抑制miR-26a-5p 可以抑制细胞增殖和侵袭，并诱导细胞的凋亡，miR-26a-5p通过激活PTEN/PI3K/AKT信号通路调控成纤维样滑膜细胞的增殖、侵袭和凋亡。miR-199a-3p 在成纤维样滑膜细胞中低表达，过表达RB1 可以逆转过表达miR-199a-3p 对成纤维样滑膜细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用。Guo等[12]研究结果显示，miR-152 在RA 血清、滑膜组织和成纤维样滑膜细胞中低表达，过表达miR-152 通过下调ADAM10抑制成纤维样滑膜细胞的增殖，促进细胞凋亡。miR-106a-5p 在大肠癌、肾细胞癌和多发性硬化症等多种疾病中异常表达[13-15]，本研究结果显示，miR-106a-5p在RA滑膜组织和滑膜成纤维细胞MH7A 中低表达，过表达miR-106a-5p 可以明显抑制滑膜成纤维细胞MH7A 的增殖和促进细胞凋亡，这说明miR-106a-5p可以作为RA的潜在生物标志物。

TLR4 属于跨膜受体家族成员之一，位于9q32-33 染色体上，在启动先天免疫应答中至关重要，而且在多种免疫细胞和肿瘤细胞中高表达，还可以激活NF-kB、IRF 等基因进而促进肿瘤的增殖、凋亡等[16-18]。TLR4 多态性与RA 有关[19]，miR-146a 通过激活TLR4/NF-kB抑制成纤维细胞样滑膜细胞的增殖及诱导细胞凋亡、炎症反应[20]。鲍晓等[21]研究结果显示，利用RNA 干扰沉默TLR4，结果显示，TLR4-siRNA可以明显抑制滑膜成纤维细胞MH7A的增殖和转移，可能与下调PCNA、MMP-9和VEGF蛋白有关。miR-708-5p 可以通过抑制LR4/NF-kB信号通路诱导滑膜成纤维细胞凋亡和炎症损伤[22]。Li 等[23]研究结果显示，在RA 患者滑膜成纤维细胞中，miR-140-5p 低表达，TLR4 高表达；miR-140-5p可以结合TLR4 的3’UTR，miR-140-5p 可以通过调控TLR4 的表达抑制细胞的增殖和炎性因子的分泌，与本研究结果一致。本研究结果显示，TLR4在RA 滑膜组织和滑膜成纤维细胞MH7A 中高表达，干扰达TLR4可以明显抑制滑膜成纤维细胞MH7A的增殖，并促进细胞凋亡。进一步实验结果显示，过表达miR-106a-5p 可以明显抑制TLR4-WT 的荧光素酶活性，对TLR4-MUT荧光素酶活性无明显变化，说明miR-106a-5p 可以靶向TLR4 的表达，过表达TLR4 可以逆转过表达miR-106a-5p 对滑膜成纤维细胞MH7A 的增殖和凋亡的影响，说明miR-106a-5p 通过靶向调控TLR4 进而发挥在滑膜成纤维细胞MH7A中的作用。

综上所述，过表达miR-106a-5p 可以明显抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖，并诱导其细胞凋亡，其作用机制可能与下调TLR4有关。