林灵，王瑜，杨娟*，李立郎，安正斌，解春芝，赵敏，杨小生

（1.贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550025）（2.贵州医科大学药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州贵阳550014）（3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550014）（4.徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州 221018）（5.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025）

失眠症是指无法得到正常睡眠的一类病症，它会引起反应迟缓、疲倦不堪、烦躁不适、头晕、注意力难以集中，严重者还会导致精神失常、焦虑、抑郁等神经功能紊乱以及心脑血管系统、循环系统等疾病[1]。西医学治疗失眠多采用巴比妥、苯二氮卓等镇静安眠药，但这些药物具有易疲乏嗜睡，头晕反胃等不良反应，长期服用会有成瘾性、阻抑呼吸系统、损害认知功能等副作用[2]，而安神类中药具有临床疗效确切、副作用小等特点被广泛应用于治疗失眠[3]。天麻（Gastrodia elataBl.）为兰科多年生异养型植物[4]，天麻常作为药膳原材料，是保健的优品。贵州省是全国中药资源最丰富的省区之一，贵州天麻中的水分含量、二氧化硫残留量、浸出物均符合2015版《中国药典》，且浸出物远高于药典标准[5]，品质较佳。天麻的活性极其丰富，研究发现其具有镇静催眠、抗惊厥[6]、保护神经细胞[7]、调节肠道菌群[8]等功效，并且对人体免疫系统、心血管系统及中枢神经系统等方面均能发挥较好的药理活性[9,10]。天麻酵素是新鲜天麻经益生菌发酵而成，相较于传统工艺制备的天麻粉，无需蒸制、烘干、整形回汗（3～4次）、粉碎等繁琐工序，可减少能耗，降低成本；其次，通过微生物发酵会产生一系列风味代谢产物，能有效改善天麻不愉悦风味，且更方便食用；此外，发酵后，不仅能将原本物质中较难利用的活性物质进行降解，还会生成丰富的小分子功能成分，更利于人体吸收与利用[11]。但相较于工艺繁杂的天麻粉，目前天麻酵素镇静催眠功效尚不明确。因此，本文分析了天麻酵素的理化指标并研究以失眠小鼠为对象，通过探究天麻酵素对失眠模型小鼠脑组织内神经递质及氧化应激水平的影响，为其镇静催眠的作用效果提供理论依据，同时为进一步探究天麻酵素改善睡眠的作用机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级KM雄性小鼠，体质量25±2 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，实验动物质量合格证号：211002300051011，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001，饲养条件为湿度60%±5%，温度25±1 ℃均给予小鼠标准颗粒饲料，自由饮水和自然昼夜节律光照，适应性饲养1周，本文所做实验均获得伦理委员会批准。

1.2 药品与试剂

天麻由贵州省德江县绿通天麻发展有限公司提供；发酵剂：贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室自制，主要的优势菌株为：酵母菌，乳酸菌，醋酸菌；枣仁安神液购自北京同仁堂股份有限公司；对氯苯丙氨酸（PCPA）购自美国Sigma公司；IL-1β试剂盒（批号：2008M-0040M2）；5-HT试剂盒（批号：2008M-0443M2）、GABA试 剂 盒（批 号：2008M-0442M2）均购自上海瑞番生物科技有限公司；SOD测试盒（批号：A001-1）、MDA测试盒（批号：A003-1）均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 实验仪器

L-8800全自动氨基酸分析仪，日本HITICHI公司；Agilent 1100型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；YL288-0-100酒精计，贵州慕为美科技有限公司；RM-255温度计，贵州慕为美科技有限公司；PHS-3C型pH计，贵州慕为美科技有限公司；ZZ-6小鼠自主活动测试仪，成都泰盟科技有限公司；KG-PB-936打浆机，上海达瑞宝公司；BS-210S型电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司；离心机，赛默飞世尔科技有限公司；VICTOR Nivo酶标仪，珀金埃尔默企业管理有限公司；SPX-100生化培养箱，上海博讯实业有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 天麻酵素的制备

新鲜天麻清洗干净后打浆，装入发酵坛内，按照其重量1:2加入沸水搅拌熟化，按照其总质量的10%添加白糖，搅拌使白糖完全溶化，待温度降至50～60 ℃时，按照其总重量的0.02%添加纤维素酶，待温度降至30～40 ℃时，按其总重量的0.03%添加酵素发酵剂，采用保鲜膜密封发酵坛在微需氧条件下发酵10 d后，去掉保鲜膜换成纱布进行有氧发酵，发酵到60 d，结束发酵，完成天麻酵素的制备。

1.4.2 天麻酵素理化指标测定

1.4.2.1 天麻酵素的pH和酒精度测定

pH测定：吸取天麻酵素20 mL于烧杯中，将pH计探测头放入烧杯测定pH值。

酒精度测定：取100 mL天麻酵素于蒸馏瓶中并加入100 mL蒸馏水，装上冷凝器和接收器，缓缓加热蒸馏，收集约95 mL馏出液时取下，加水定容至100 mL，摇匀备用。用酒精计和温度计进行测量，记录测得的温度和酒精计示值，查GB 5009.225-2016中的附录B，计算其酒精度。

1.4.2.2 天麻酵素中对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛的含量测定

色谱条件与方法：Syncronis C18色谱柱(4.60 mm×250 mm，5 µm)，柱温30 ℃；流量1 mL/min；进样体积10 µL；检测波长220 nm；流动相A为0.05%（体积分数，下同）磷酸溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～10 min，B为10%；10～15 min，B由10%升至20%；15～20 min，B由20%升至25%；20～40 min，B由25%升至45%。将天麻酵素用0.45 µm微孔滤膜过滤后得样品溶液[12]。

1.4.2.3 天麻酵素中γ-氨基丁酸的含量测定

色谱条件与方法：色谱柱为标准分析阳离子型交换树脂（LCAK07/Li）；进样量50 μL；检测波长：570 nm；输液泵压力0～4.20 MPa；流流速：洗脱泵0.45 mL/min；茚三酮衍生泵0.25 mL/min；分离柱温度为37 ℃，反应器温度为130 ℃。准确称量1.02 g磺基水杨酸至100 mL容量瓶中并定容，配制成1%的磺基水杨酸溶液；取天麻酵素样品1 mL分别加入9 mL磺基水杨酸溶液，震荡均匀，10000 r/min离心15 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤后放入全自动氨基酸分析仪中检测[13]。

1.4.3 分组、造模及给药

将70只KM小鼠按体质量随机分为7组，每组10只，依次为空白对照组、模型组、枣仁安神液组2.40 mL/kg（阳性对照组1，蒸馏水配制）、天麻粉组0.48 g/kg（阳性对照组2，蒸馏水溶解配制）、天麻酵素低（0.10 g/kg）、中（0.30 g/kg）、高（0.49 g/kg）剂量组。除空白组外，其余各组小鼠每天上午8:00～9:00腹腔注射PCPA混悬液（350 mg/kg）（生理盐水溶解，pH为7～8），1次/d，连续注射3 d，观察小鼠行为。3 d后，与空白组比较，其他组小鼠出现昼夜节律紊乱、白天活动不停、毛发杂乱、兴奋性增强、攻击性增强、大便灰白等显著的行为学改变，表明失眠模型制备成功[14]。造模后进行灌胃，给药容积为0.1 mL/10 g，正常对照组与模型组按比例灌服同体积生理盐水。各组小鼠上午8:00～9:00灌胃给药1次，下午16:00～17:00灌胃给药1次，2次/d，连续7 d。

1.4.4 天麻酵素对小鼠体重和自主活动的影响

在实验前、灌胃7 d时分别称定每只小鼠体重。在第5 d给药60 min后，将小鼠放入自主活动记录仪小室内，适应环境3 min，用自主活动仪连续记录5 min内小鼠活动时间和站立次数（前肢向上抬举次数）。

1.4.5 天麻酵素对失眠模型小鼠脑组织内神经递质及氧化应激水平的影响

各组小鼠灌胃给药7 d后，将其断头处死，迅速取出小鼠脑组织，经生理盐水冲洗后称质量，加生理盐水制备10%的脑组织匀浆。4 ℃下3500 r/min离心10 min（离心半径10 cm）后取上清液，于-20 ℃或-80 ℃低温保存。采用酶联免疫吸附法严格按照相应试剂盒说明书进行操作，测定各组小鼠脑组织内神经递质5-HT、GABA、IL-1β的含量变化，以MDA含量和SOD活性评价氧化应激水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行差异显著性分析，p<0.05或p<0.01为具有统计学意义，所有数据均以±SD表示，用Origin 9.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 天麻酵素理化指标分析

发酵60 d天麻酵素基本理化指标包括pH和酒精度，特征理化指标包括γ-氨基丁酸、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛。QB/T 5232-2018标准中要求植物酵素pH在4.50以内，酒精度在0.50 g/100 g以内，而天麻酵素的pH和酒精度分别为3.51、0.36 g/100 g，符合标准中所要求的植物酵素基本指标范围。特征指标中，γ-氨基丁酸是一种抑制性神经递质，广泛分布于外周神经系统和中枢神经系统，对哺乳动物中枢神经系统具有普遍的抑制作用[15]，对羟基苯甲醇是一种潜在的抗失眠药物，其衍生物可逆转对氯苯丙氨酸（PCPA）引起的失眠[16]，在天麻酵素中，γ-氨基丁酸含量为0.48 mg/kg，是QB/T 5232-2018标准中要求（0.03 mg/kg以上）的16倍，对羟基苯甲醇的含量为6.59 g/100 g，对羟基苯甲醛的含量为0.13 g/100 g。

表1 发酵60 d天麻酵素理化指标测定结果Table 1 Results of physical and chemical indexes of Gastrodia elata fermentation for 60 days

2.2 天麻酵素对小鼠体重的影响

各组小鼠体重变化如图1所示，图中所示的3 d为造模结束时间，10 d为给药7 d的时间，造模3 d后与造模前（1 d）相比，各组小鼠体重虽有下降，但均无统计学意义，是因造模结束后，模型组小鼠昼夜节律紊乱、皮毛蓬乱无泽、攻击性增强，白天不停走动，小鼠由于失眠体重减少；给药7 d后与造模结束（3 d）相比，各组小鼠体重均显著性增加（p<0.01），是因给药后，小鼠状态逐渐好转，白天活动减少，睡眠时间延长，小鼠体重有所提升。

图1 各组小鼠体重变化图Fig.1 Body weight changes of mice in each group

2.3 天麻酵素对小鼠自主活动的影响

睡眠是涉及多系统的复杂生理过程[17]。可通过小鼠的自主活动情况来反映中枢神经系统的功能状态，活动次数减少代表中枢神经系统被抑制，活动次数增加代表中枢神经系统兴奋[18]。由表2可知，模型组小鼠的活动时间和站立次数与空白组相比差异显著（p<0.05），表明小鼠失眠模型建立成功；而枣仁安神液组（阳性对照组1）、天麻粉组（阳性对照组2）、天麻酵素高、中、低剂量组与模型组相比，小鼠的活动时间和站立次数均有所减少，活动时间分别减少10.50 s、11.00 s、13.00 s、14.63 s、4.50 s，站立次数分别减少10.87次、10.50次、10.62次、9.12次、9.35次，与模型组相比均差异显著（p<0.05），说明天麻酵素与天麻粉[19]、枣仁颗粒[20]一样，具有一定的镇静效果和明显抑制小鼠自发活动的作用。

表2 各组小鼠自主活动相关指标测定结果Table 2 Determination results of autonomic activity related indexes of mice in each group (x±s, n=10)

2.4 天麻酵素对失眠模型小鼠脑组织内神经递质的影响

失眠是一种由众多神经递质参与的神经调节过程[21]。失眠患者中枢神经系统兴奋和抑制的平衡被破坏时会引起脑内神经递质含量的改变[22]，其中相关的神经递质有5-羟色胺（5-HT）[23]、γ-氨基丁酸（GABA）[24]、细胞因子白细胞介素1β（IL-1β）[25]等，而脑组织是5-HT、GABA、IL-1β等神经递质的共同主要来源[26]，因此选择脑组织作为本研究的对象。

由表3可知，模型组与空白组相比，小鼠脑组织内5-HT、GABA、IL-1β含量存在显著性差异（p<0.01），表明小鼠失眠模型建立成功。而枣仁安神液组（阳性对照组1）、天麻粉组（阳性对照组2）、天麻酵素高、中、低剂量组与模型组相比都能增加小鼠脑组织内5-HT、GABA、IL-1β含量，小鼠脑组织内5-HT含量分别增加53.06 pg/mL、37.95 pg/mL、50.62 pg/mL、49.51 pg/mL、46.77 pg/mL，与模型组相比均差异显著（p<0.05）；小鼠脑组织内GABA含量分别增加4.78 ng/mL、3.66 ng/mL、5.47 ng/mL、5.15 ng/mL、3.63 ng/mL，与模型组比均差异极显著（p<0.01）；小鼠脑组织内IL-1β含量分别增加19.44 ng/L、17.90 ng/L、17.82 ng/L、26.64 ng/L、8.45 ng/L，其中，枣仁安神液组、天麻粉组、天麻酵素高剂量组与模型组相比差异显著（p<0.05）、天麻酵素中剂量组与模型组相比差异极显著（p<0.01）、低剂量组对比IL-1β含量虽有增加，但无统计学意义。且天麻酵素高剂量组小鼠脑组织内GABA含量比天麻粉组增加1.81 ng/mL，与天麻粉组相比差异显著（p<0.05）。卞勇等[27]发现乐眠胶囊具有治疗失眠的功效，且百乐眠胶囊高剂量组使小鼠脑组织内GABA含量提升34.92%、中剂量组使小鼠脑组织内5-HT含量提升11.89%，而天麻酵素高剂量组（202.59%）所提升GABA含量的是其6倍，中剂量组（32.9%）所提升5-HT含量的是其2倍。实验结果表明，天麻酵素能提高小鼠脑组织内神经递质的含量，和天麻粉[28]、苏格木勒-3汤[14]一样具有相同功效，而且给予天麻酵素治疗后，各剂量组小鼠昼夜节律有所好转，白天能较安静入睡，行为活动趋于正常。

表3 天麻酵素对失眠模型小鼠脑组织内神经递质含量的影响Table 3 Effects of Gastrodia elata Bl. ferment on the content of neurotransmitters in brain tissue of mice with insomnia model (x±s, n=10)

2.5 天麻酵素对失眠模型小鼠脑组织内氧化应激水平的影响

氧化应激反应是指在体内氧化平衡失调的情况下自由基增加导致的各类蛋白酶水平增高、中性粒细胞炎性浸润等一系列负面反应[29]，超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）能较为全面地反映氧化应激反应综合水平。脑部对氧化与抗氧化反应比较敏感，并且SOD和MDA也被发现在睡眠-觉醒节律过程中起到一定的作用，当鼠脑组织内SOD活性降低、MDA含量增加时，会出现失眠症状[30]。

由表4可知，模型组与空白组相比，小鼠脑组织内SOD活性与MDA含量存在显著性差异（p<0.05），表明小鼠失眠模型建立成功。而枣仁安神液组（阳性对照组1）、天麻粉组（阳性对照组2）、天麻酵素高、中剂量组与模型组相比小鼠脑组织内SOD活性均有所提高，分别提高29.47%、9.51%、13.46%、17.84%，与模型组相比均差异显著（p<0.05）。而枣仁安神液组（阳性对照组1）、天麻粉组（阳性对照组2）、天麻酵素高、中、低剂量组与模型组相比小鼠脑组织内MDA含量均有所降低，分别降低20 U/mg prot、4.50 U/mg prot、16.50 U/mg prot、24.20 U/mg prot、20.90 U/mg prot，其中枣仁安神液组、天麻酵素高、中、低剂量组与模型组相比差异显著（p<0.05）、天麻粉组差异不显著。韩金美等[14]发现苏格木勒-3汤具有改善睡眠功效，且苏格木勒-3汤低剂量组使大鼠脑组织内MDA含量降低了7.09%，而天麻酵素低剂量组降低的小鼠脑组织内MDA含量（15.69%）是其2倍。实验结果表明，天麻酵素可通过调节小鼠脑组织氧化应激水平来调节机体抗氧化能力而达到改善睡眠的效果。

表4 天麻酵素对失眠模型小鼠脑组织氧化应激水平的影响Table 4 Effects of Gastrodia elata Bl. ferment on oxidative stress level of brain tissue in mice with insomnia model (x±s, n=10)

3 结论

本文通过分析天麻酵素理化指标并研究天麻酵素对失眠模型小鼠脑组织内神经递质和氧化应激水平的调节作用，发现天麻酵素中γ-氨基丁酸含量为0.48 mg/kg，是QB/T 5232-2018标准中要求的16倍，对羟基苯甲醇的含量为6.59 g/100 g，对羟基苯甲醛的含量为0.13 g/100 g；动物实验结果表明，天麻酵素能调节小鼠脑组织内神经递质含量以及氧化应激水平，天麻酵素高、中剂量组与模型组相比均能增加小鼠脑组织中5-HT、GABA、IL-1β含量、提高SOD活性、降低MDA含量，5-HT分别增加50.62 pg/mL、49.51 pg/mL，GABA分别增加5.47 ng/mL、5.15 ng/mL，IL-1β分别增加17.82 ng/L、26.64 ng/L，SOD活性分别提高13.46%、17.84%，MDA含量分别降低12.39%、18.17%，且与模型组相比均有显著性差异（p<0.05）；天麻酵素高剂量组与天麻粉组相比小鼠脑组织内GABA含量显著增加1.81 ng/mL，差异显著（p<0.05）。因此，相较于工艺繁琐的天麻粉，天麻酵素同样具有镇静催眠功效，经益生菌发酵的天麻酵素，产生的次级代谢产物更利于消化吸收，且风味佳、食用方便、能耗低，可为天麻的开发利用提供新途径。同时，该研究可为后期基于代谢组学及肠道菌群探讨天麻酵素镇静催眠作用机制提供有效的理论和有效数据支撑，并为治疗失眠提供新思路。