钱腊燕 武晓芳 刘彦龙 凡奇 马龙

短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）是指在一定时间内发生缺血同时又迅速缓解的症状，症状持续时间短，一般1～24 h 内即可恢复正常［1-2］。近年来，临床研究发现约有50%的TIA 患者在发病后的48 h 内进展为缺血性卒中（ischemic stroke，IS），具有较高的危险系数［3］。故早期诊断和治疗TIA 对于预防IS 的发生具有重要意义。miRNA 在血管性疾病、肿瘤等多种疾病中具有重要的调控作用［4-5］。既往研究发现miR-450b-5p 不仅与恶性肿瘤发生发展密切相关，还参与多种炎症性疾病［6］。Huang 等人［7］研究显示miR-450b-5p 通过抑制αB-晶状体蛋白可改善肝脏缺血性损伤。Luo 等人［8］通过生物信息学分析发现miR-450b-5p 可调控信号通路活性改变，影响脑组织细胞的生物活性，这为后期研究提供了思路。因此，本研究通过观察不同危险分级以及预后TIA 患者外泌体miR-450b-5p 表达水平，旨在初步探讨外泌体miR-450b-5p 在TIA 发生发展中的作用，为临床诊治TIA 提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取亳州市人民医院2017年1月至2019年6月诊治的142 例TIA 患者作为TIA 组。纳入标准：①符合2009年美国心脏协会/脑卒中协会制定的TIA 诊断标准［9］，并经影像学检查确诊；②患者临床资料完整。排除标准：①经CT 或MRI 检查证实为新发梗死病灶导致；②经CT 或MRI 检查证实为颅内出血、感染等其他神经系统疾病；③既往存在脑卒中病史；④合并严重脏器功能不全、自身免疫性疾病者；⑤近半年内存在脑部手术或外伤史。其中男109 例，女33 例；平均年龄（53.49±8.16）岁；基础疾病：高血压24 例，糖尿病29 例。另选取同期来本院体检的133 例健康人作为对照组，其中男104 例，女29 例；平均年龄（52.67±7.92）岁。两组基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有较好的可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准通过，受试者或家属均签署知情同意书。

1.2 方法

TIA 组患者入院后次日、对照组于体检当日清晨抽取空腹静脉血3 mL，室温下以3 000 r/min 的速度离心10 min，收集上层血清，然后在4℃、14 000 r/min 的条件下，离心10 min，取上层清液保存于-80℃。将上清液经0.22 gm 滤膜过滤，DPBS 洗两次，收集截留物，经戊二醛固定，柠檬酸铅染色，再通过透射电镜法观察提取外泌体。采用Trizol 法提取外泌体中的总RNA 分子，并参考miRcute 血清miRNA 提取分离试剂盒说明书提取外泌体中的miR-450b-5p，采用实时荧光定量PCR 检测外泌体miR-450b-5p 水平。反应条件按照试剂盒说明书进行：第一阶段，95℃30 s 预变性，1 个循环；第二阶段，95℃5 s、60℃30 s，40 个循环。以小核RNAU6作为内参，对目标基因进行归一化处理。目标miRNA 的相对表达量=2-ΔΔCT，CT 值为反应体系中荧光信号达到阈值时的循环数。患者入院时或者TIA发作后进行ABCD2 评估，评估标准［10］如下：A：年龄≥60 岁，计为1 分；B：血压≥140/90 mmHg，计为1分；C：临床表现：单侧肢体无力计为2 分，有言语障碍而无肢体无力，计为1 分；D 症状持续时间：≥60 min，计为2 分，10～59 min，计为1 分；D 糖尿病：口服降糖药或应用胰岛素治疗，计为1 分。其中低危组为0～3 分，中危组为4～5 分，高危组为6～7 分。

1.3 观察指标

比较TIA 组与对照组miR-450b-5p 水平，并比较不同危险分级TIA 患者ABCD2 评分、外泌体miR-450b-5p 水平，并分析两者相关性。通过电话或者门诊形式随访，统计患者90 d 内是否发生脑梗死、死亡、大动脉狭窄等不良事件，根据有无发生将患者分为预后不良组和预后良好组，比较两组患者ABCD2 评分和外泌体miR-450b-5p 水平，并通过ROC 曲线分析两者对预后的预测价值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计软件进行统计处理，计量资料数据均符合正态分布，以（）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素-方差（F检验）分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。ABCD2 评分、外泌体miR-450b-5p 水平相关性采用Pearson 相关分析。ABCD2 评分、外泌体miR-450b-5p 水平对TIA 患者预后的预测价值采用受试者工作特征（ROC）曲线分析；以ROC 曲线下面积值（AUC）反映预测效能，AUC 值的比较采用Z 检验；以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TIA 组与对照组外泌体miR-450b-5p 水平比较

TIA 组外泌体miR-450b-5p 表达水平为（0.64±0.20），明显低于对照组外泌体miR-450b-5p表达水平（0.98±0.34），差异有统计学意义（t=10.134，P＜0.05）。

2.2 不同危险分级患者ABCD2 评分和外泌体miR-450b-5p 水平比较

ABCD2 评分：高危组＞中危组＞低危组、外泌体miR-450b-5p 表达水平：高危组＜中危组＜低危组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同危险分级患者ABCD2 评分和外泌体miR-450b-5p 水平比较（±s）Table 1 ABCD2 scores and exosome miR-450b-5p levels in patients with different risk classification（±s）

表1 不同危险分级患者ABCD2 评分和外泌体miR-450b-5p 水平比较（±s）Table 1 ABCD2 scores and exosome miR-450b-5p levels in patients with different risk classification（±s）

注：与低危组比较，aP＜0.05；与中危组比较，bP＜0.05。

分组低危组中危组高危组F 值P 值n 46 67 29 ABCD2 评分（分）2.22±0.63 4.46±0.52a 6.41±0.50ab 530.298＜0.001外泌体miR-450b-5p 0.84±0.26 0.65±0.19a 0.31±0.12ab 59.678＜0.001

2.3 ABCD2评分与外泌体miR-450b-5p水平相关性

外泌体miR-450b-5p 水平与ABCD2 评分呈负相关（r=-0.611，P＜0.05）。

2.4 不同预后患者ABCD2 评分和外泌体miR-450b-5p 水平

所有患者均完成随访，根据有无发生不良事件将患者分为预后不良组（n=38）和预后良好组（n=104）。预后良好组患者ABCD2 评分明显低于预后不良组，外泌体miR-450b-5p 水平明显高于预后不良组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同预后患者ABCD2 评分和外泌体miR-450b-5p水平（±s）Table 2 ABCD2 scores and exosome miR-450b-5p levels in patients with different prognosis（±s）

表2 不同预后患者ABCD2 评分和外泌体miR-450b-5p水平（±s）Table 2 ABCD2 scores and exosome miR-450b-5p levels in patients with different prognosis（±s）

分组预后良好组预后不良组t 值P 值n 104 38 ABCD2 评分（分）3.85±1.71 4.90±1.38 3.400 0.001外泌体miR-450b-5p 0.72±0.21 0.43±0.18 7.555＜0.001

2.5 ABCD2 评分和外泌体miR-450b-5p 水平对预后的预测价值

外泌体miR-450b-5p 联合ABCD2 评分评估TIA 预后的AUC 为0.819，大于两者单独检测（P＜0.05），两者联合预测的敏感度为84.21%，特异度为69.27%。见表3、图2。

表3 ABCD2 评分和外泌体miR-450b-5p 水平对预后的预测价值Table 3 The prognostic value of ABCD2 score and exosome miR-450b-5p level

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curves

3 讨论

目前临床认为TIA 的发病与血流动力学变化以及微栓子形成有关，是IS 的先兆性症状，其反复发作最终可发展为不可逆的脑梗死［11］。既往研究表明影像学检查对于TIA 病情评估方面仍存在一定的局限性［12］。国内外已有多项研究表明外泌体miRNAs 可能与TIA 的发生发展密切相关［13-14］，Luo 等人［8］以TIA 大鼠为对象，通过一系列试验证实miR-450b-5p 对于TIA 大鼠具有较高的诊断价值，可能成为大鼠TIA 的生物学标志物及治疗靶点。但miR-450b-5p 水平与人体TIA 的关系尚处于初步研究阶段，国内外鲜有报道。

既往研究表明外泌体是miRNAs 的运载体和富含体，在脑缺血后的几分钟开始，脑组织将出现包括基因表达变化等各种各样的由缺血直接导致的功能损害［15］。本研究发现miR-450b-5p 水平在TIA 中明显降低，Luo 等人［8］研究也表明TIA 大鼠中miR-450b-5p 水平显著降低。另研究结果提示miR-450b-5p 可能参与TIA 的发生发展过程中，可与ABCD2 评分共同用于TIA 患者病情进展的监测。TIA 与IS 的症状相同，具有相似的病理生理机制，包括钙离子代谢异常、氧化应激、细胞凋亡、免疫反应等。而新的研究表明miRNAs 参与了淋巴细胞的形成和分化过程，从而参与调控免疫反应环节，间接参与脑缺血的发生［16］。在众多的miRNAs 中，miR-450b-5p 也是一个免疫相关性miRNA。Li 等人［17］研究表明miR-450b-5p 与核因子-kB（Nuclear factor-kB，NF-kB）表达增强密切相关，且miR-450b-5p 在免疫反应的早期以及炎症反应各阶段发挥作用。而TIA 患者因脑缺血的发生，血脑屏障被破坏，促使炎症反应发生，诱导NF-κB的激活，参与TIA 后炎症反应，进一步加重脑损伤的发生，促进TIA 病情进展。Zhang 等人［18］研究表明miR-450b-5p 靶基因还与钙离子转运、基因表达调节、细胞粘附调节、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β 信号通路、MAPK 信号传导等有关。如MAPK 途径作为保护血脑屏障的关键途径，可促进脑梗死后血管生成；细胞内钙离子浓度升高、细胞凋亡以及线粒体损伤均是引起大脑中动脉阻断后缺血性再灌注损伤的重要因素；ABCD2 评分是现阶段常用的预测TIA 进展为IS 风险以及预后的评估工具，具有快捷、操作简单、经济等优点，但其评估指标未涉及病理生理因素、影像学检查结果，故单纯依靠ABCD2 评分预测TIA 预后尚存在一定的局限性。本研究以患者不同预后进行分组，结果显示外泌体miR-450b-5p 联合ABCD2 评分评估TIA 预后的AUC 明显大于两者单独诊断，两者联合预测的敏感度为84.21%，特异度为69.27%，提示外泌体miR-450b-5p 可与ABCD2 评分联合为TIA 的预后预测提供一定的参考。

综上所述，TIA 患者外泌体miR-450b-5p 表达水平与ABCD2 评分呈负相关，两者水平升高增高可提示TIA 患者预后不良。但本次研究仍存在部分局限之处，样本量较少，数据可能存在一定的偏倚，关于miR-450b-5p 在TIA 发生发展中扮演的角色以及其具体的作用机制仍有待于进一步研究。