陈小珠，黄凤荣，刘运洪，刘淑军，谭钢文

（1.深圳市龙华区人民医院超声科，广东深圳 518109；2.深圳市龙华区人民医院心内科，广东深圳 518109；3.深圳市龙华区人民医院检验科，广东深圳 518109）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者因发生急性冠状动脉阻塞导致心肌缺血坏死，可引起相对应心肌的运动及功能受损。心肌肌钙蛋白（cardiac troponin，cTn）等标志物是确诊AMI 的“金标准”，然而这些标志物仅在AMI 急性发病前3～6 h 会升高，预警时效性不足，临床上多半不能在患者急性发病前通过这些指标进行及时的判断和做出干预。因此，寻找预警时效更早的诊断方法很有必要。实时三维斑点追踪超声心动图（real-time three dimensional speckle tracking echocardiography，RT3D-STE）评估非透壁梗死和透壁梗死的左心室应变有差异［1-2］。在心肌损伤释放出cTn 之前，三维（3D）左心室应变就开始下降，随疾病进展，可出现左心室不良重构［3-4］。大量研究表明，微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）在心肌梗死后的细胞凋亡、血管生成以及梗死后的心肌修复中起到关键作用［5］。由于miRNA 是调控性RNA，在疾病早期即有显著变化，现有研究证实，miRNA 的不同亚型在AMI 出现了不同程度的上调或下调，是极具诊断潜能的生物标志物［6］。因此，本研究应用RT3D-STE 检查和外泌体miRNA 检测，研究其在评估早期AMI 危险程度中的价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2019 年3 月至2021 年7 月入住深圳市龙华区人民医院并行冠状动脉造影（coronary angiography，CAG）的40 例AMI 患者为研究对象，其中男34例，女6例，年龄（52.9±10.63）岁。所有入组的AMI 患者均为首次发作。本研究经深圳市龙华区人民医院医学伦理委员会批准，已取得所有入选者的知情同意，并签署知情同意书。AMI 诊断符合2018 年“心肌梗死全球统一定义”的诊断标准［7］，排除了患有心房颤动、外伤、脑卒中、急性感染、合并自身免疫病、严重肝及肾功能障碍、恶性肿瘤等疾病的患者。另选同期于深圳市龙华区人民医院参加体检的20 名健康者为对照组（正常组），其中男17 例，女3 例，年龄（50.05±4.80）岁。收集所有研究对象的临床基础资料，包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、原发性高血压（高血压）病史、糖尿病病史、高脂血症病史、胸痛史、Killip 分级；生化指标检查：血脂、血糖、肾功能、心肌酶及心肌二项［肌红蛋白（myohemoglobin，MYOG）、cTnI］。

1.2 实时三维斑点追踪超声心动图检查

所有AMI 患者均在行CAG 后24 h 内，由一名专职医生进行RT3D-STE 检查。采用GE Vivid E9彩色多普勒超声诊断仪，4V 矩阵探头，频率1.5～4.0 MHz，4DAutoLVQ 分析软件。所有受检者均取左侧卧位，同步记录心电图，先进行常规二维超声检查，然后在标准心尖四腔观采集单一心动周期左心室三维容积动态图像。启动4DAutoLVQ 分析软件并按步点击，软件自动计算出左心室舒张末期容积（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收缩末期容积（left ventricular end systolic volume，LVESV）、左心室每搏输出量（left ventricular stroke volume，LVSV）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、心排血量（cardiac output，CO）、球形指数（spherical index，SpI）及左心室质量（left ventricular mass，LVMass），并获取三维左心室整体长轴应变（three-dimensional global long axis strain，3D-GLS）、环周应变（threedimensional global circumferential strain，3D-GCS）、径向应变（three-dimensional global radial strain，3DGRS）及面积应变（three-dimensional global area strain，3D-GAS）和17 节段纵向应变（segmental longitudinal strain，SLS）、环周应变（segmental circumferential strain，SCS）、径向应变（segmental radial strain，SRS）、面积应变（segmental area strain，SAS）的彩色编码牛眼图，见图1（A-D）。

图1 同一AMI 患者（男，53 岁）的RT3D-STE 图像（A：LVEF 为62.64%、SpI 为0.31，心内、外膜心肌质量为141 g、143 g；B：长轴应变，显示3D-GLS 及17节段LS；C：面积应变，显示3D-GAS 及17节段AS；D：径向应变，显示3D-GRS 及17节段RS）

1.3 分组及miRNA 检测方法

由心血管内科医师依据所有AMI 患者的CAG结果在SYNTAX 自有网在线计分，将SYNTAX 评分≥23 分且“罪犯血管”为近端闭塞者分为高危组，将SYNTAX 评分＜23 分且“罪犯血管”为中远端闭塞者分为低危组，每组各20 例。所有AMI 患者在CAG 前采集外周血血清存储，为了防止误差，在所有样本收集完毕后，选取20 例集中进行外泌体miRNA 测序（由深圳市承启生物科技有限公司根据合同承担）。高质量的reads 去接头后，使用FANSe3 序列比对算法［8］向人类成熟miRNA 参考序列上比对，以每百万读数的转录本（transcripts in million，TPM）对miRNA 进行定量标准化。使用edgeR［9］算法进行差异表达分析。上调或下调超过2 倍的miRNA，且错误发现率（FDR）＜0.01 被定义为显著差异表达的miRNA。分别与CAG 分组结果、三维左心室应变参数进行相关分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件统计分析。正态分布计量资料以（）表示，两组间比较用独立样本t检验，3 组间比较用单因素方差分析。偏态分布的计量资料采用中位数［M（Q1～Q3）］表示，组间比较采用非参数检验。分类变量采用［n（%）］表示，组间比较用卡方（χ2）检验。两组间相关性分析采用Pearson 检验。绘制受试者工作特征（receptor operating characteristic，ROC）曲线分析应变指标对冠状动脉闭塞病变的评估价值。以P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高危组、低危组和正常组研究对象的临床资料和生化指标比较

3 组研究对象的一般临床资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；生化指标中高危组和低危组患者的心肌酶及心肌二项均显著高于正常组，且高危组高于低危组，差异有统计学意义（P＜0.05）；3 组研究对象其余生化指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05），详见表1。

表1 3 组研究对象的临床资料、生化指标及冠状动脉病变比较 ［n=20，n（%），M（Q1～Q3），］

表1 3 组研究对象的临床资料、生化指标及冠状动脉病变比较 ［n=20，n（%），M（Q1～Q3），］

注：与正常组比较，**P＜0.01；与低危组比较，1）*P＜0.05

2.2 3 组研究对象RT3D 左心室一般参数比较

高危组患者RT3D 左心室一般参数与低危组、正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且LVEF低于50%；低危组患者的CO 及LVEF 比正常组低，差异有统计学意义（P＜0.001），其他参数与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），详见表2。

表2 3 组研究对象RT3D 左心室一般参数比较 ［n=20，］

表2 3 组研究对象RT3D 左心室一般参数比较 ［n=20，］

注：与正常组比较，*P＜0.05；与低危组比较，1）*P＜0.05

2.3 3 组研究对象RT3D 左心室应变参数比较

高危组患者的左心室应变参数（3D-GLS、3D-GCS、3D-GAS及3D-GRS）与低危组、正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）；3组研究对象的RT3D左心室应变参数差异变化程度为高危组＞低危组＞正常组，差异有统计学意义（P＜0.001），详见表3。

表3 3 组研究对象RT3D 左心室应变参数比较 ［n（%），n=20，］

表3 3 组研究对象RT3D 左心室应变参数比较 ［n（%），n=20，］

注：与正常组比较，**P＜0.01；与低危组比较，1）**P＜0.05

2.4 受试者工作特征曲线分析结果

RT3D 左心室应变参数（3D-GLS、3D-GCS、3D-GAS 及3D-GRS）鉴别高危组与低危组的ROC曲线详见图2，诊断效能详见表4，曲线下面积（area under the curve，AUC）由大到小依次为3D-GLS（0.908）、3D-GAS（0.894）、3D-GRS（0.874）及3DGCS（0.803）。以3D-GLS＝-9.31%为临界值，其诊断敏感度为80%，特异度为90%。

图2 整体应变参数高危组与低危组的ROC 曲线图

表4 RT3D 应变参数诊断高危组的ROC 曲线分析结果 ［n=40］

2.5 RT3D 左心室应变参数区分高危组、低危组和正常组的效果分析

精细分析RT3D 左心室应变参数的GLS、GAS、GRS、GCS 4 个指标，每个指标都能显著区分高危组、低危组和正常组，详见图3A；Mann-Whitney Utest 的P值，除了GAS 在高危组和低危组中为0.0011，其余均在10-5～10-8，详见图3B。将4 个指标做主成分分析，第一个主成分（PC1）占了91.73%的贡献率，也能极显著地区分开3 组，详见图3C（Mann-Whitney U-test，P＜10-5）。

图3 左心室应变指标对高危组、低危组、正常组的区分效果（A：4 项指标对3 组的区分；B：对（A）中各组之间两两比较的Mann-Whitney U-test 结果；C 将4 个指标进行PCA 分析，取PC1 进行绘图）

2.6 从外泌体miRNA 中寻找区分高危组、低危组和正常组的分子标志物

为了区分高危组和低危组，我们选取了以下的外泌体miRNA 筛选标准：（a）按差异程度排序在前200 名；（b）高危、低危组和正常组均差异有统计学意义；（c）Kendall correlation 绝对值＞0.5；（d）该miRNA 的量与RT3D 左心室应变指标的Pearson 相关系数均＞0.6。经此4 项条件的筛选，最终筛选出2 个外泌体miRNA：miR-3681-5p 和miR-152-5p，其与3D-GLS、3D-GAS、3D-GCS 呈负相关，与3D-GRS 呈正相关，Pearson 相关系数为0.69～0.83，详见图4。

图4 左心室应变参数与miRNA 的相关性分析图

2.7 miR-3681-5p 和miR-152-5p 是高效区分高危组、低危组和正常组的miRNA 标志物

使用实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）对miR-3681-5p 和miR-152-5p 进行验证，以U6 为内参。高危组、低危组和正常组3 组各6 个样本的qRTPCR 结果显示，单个miR-3681-5p 即可完全区分3 组（P=0.0013，Kolmogorov-Smirnovtest）。miR-152-5p 不能有效区分低危组和正常组（P=0.32，Kolmogorov-Smirnovtest），但可以区分高危组和低危组（P=0.0013，Kolmogorov-Smirnovtest），详见图5。因此，miR-3681-5p 和miR-152-5p 很可能是高效区分3 组的miRNA 标志物。

图5 miR-3681-5p 和miR-152-5p 的qRT-PCR 验证图

3 讨论

随着国家胸痛中心规范性的建设，及时对AMI 患者施行CAG 并开通闭塞的冠状动脉血管，挽救缺血濒死的心肌，已经大大提高了AMI患者的临床救治效率。但是，对三支主要冠状动脉病变伴近端闭塞的AMI 患者而言，往往因严重的心肌缺血坏死对心功能损伤严重，预后不良，即使进行了经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary stent implantation，PCI）治疗，其后出现主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）的危险性仍然很大，尽早识别判断、尽早干预救治是减少MACE的关键［10-11］。本研究AMI患者分为高危组和低危组，能够突出AMI 患者冠状动脉病变的不同危险程度［12］。

RT3D-STE 可通过心脏全容积图像获取多个应变参数，克服了2D-STE 的平面依赖，有利于准确评价左心室心肌整体及局部功能，而三维应变为心肌在三维方向上应变的综合，能更敏感地评估心肌功能。本研究应用RT3D-STE 评价AMI高危患者，结果显示随着冠状动脉病变复杂程度的加重，高危患者的SpI、CO、LVEF 显著降低，三维应变参数异常严重，虽然3D-GLS、3D-GAS、3D-GCS 及3D-GRS 这4 个指标均能够鉴别高危患者，但以3D-GLS 和3D-GAS 检测高危患者的敏感性最强，以3D-GLS＝-9.31%为临界值，敏感度为80%，特异度为90%。有研究显示，AMI 患者如果在PCI 治疗后持续存在明显的心肌应变参数异常，特别是长轴方向运动异常，往往预后不良，容易出现PCI 治疗后再发心肌梗死、再发心力衰竭、恶性心律失常或死亡等MACE 事件［13］。因此，对超声参数——SpI、CO、LVEF、3D-GLS 和3D-GAS显著异常的的高危患者进行长期（2.5 年）的随访，动态监测上述指标，可以观察其对MACE 或者生存率是否具有相关指导意义。

外泌体miRNA 是内源基因编码的、长度约为18～22 个核苷酸的非编码单链RNA［14］，是调控特定基因翻译的调控性RNA，其变化通常早于蛋白质的变化，而蛋白质的变化又早于病理损害的发生，因此，外泌体miRNA 理论上可以在病理损害尚未发生时即发生变化，从而进行极早期的预警。研究发现，在AMI 梗死边缘和梗死区域的早期阶段（6 h）存在多种miRNA 的异常表达，因此，miRNA可能作为潜在的心肌梗死诊断标志物［15-17］。本研究应用RPM 定量筛选出两个miRNA，即miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p，相关分析发现miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p 与3D-GLS、3D-GAS 及3D-GCS 呈负相关，与3D-GRS 呈正相关；使用qRT-PCR 对miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p 进行验证显示，单个miRNA-3681-5p 即可高效完全区分高危组、低危组和正常组，miRNA-152-5p 可高效区分高危组和低危组。因此，miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p 很可能是高效区分高危组、低危组和正常组的miRNA 标志物。这些在国内目前尚未见到相关的研究报道。

综上所述，本研究应用RT3D-STE 和miRNA评估AMI 的结果，可能对AMI 早期危险分层有一定指导作用，但还需进一步前瞻性实验证实应用。高危患者异常的超声参数（SpI、CO、LVEF、3D-GLS 和3D-GAS）有望成为AMI 患者PCI 治疗后随访MACE 或者生存率相关的评估指标。

利益冲突声明：在此次研究过程中或得到的研究结果均未受到任何机构或生产商的影响。