徐剑波 王丹丹 彭旭霖 宋飞翔 王春笛

复发性口腔溃疡属常见的一种口腔黏膜溃疡疾病，其具体发病机制尚未完全阐明［1］。现代医学认为，复发性口腔溃疡的发生、发展可能与局部创伤、微生物感染、精神状态、微循环障碍、维生素缺乏、免疫、化合物和药物、遗传及不良生活习惯等有关［2］。复发性口腔溃疡反复发作不仅造成持续性疼痛，且会造成咀嚼吞咽困难，严重影响患者食欲和进食［3］。因此，采取及时有效的诊断和治疗复发性口腔溃疡方法尤为重要。有研究结果显示，口腔菌群、体内炎性因子水平及免疫功能状态等均与口腔疾病的发生、发展密切相关［4-6］。本文研究探讨了口腔菌群及血炎性因子、T 细胞亚群水平在复发性口腔溃疡患者病情中的变化及意义，旨在为诊断和治疗复发性口腔溃疡提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择于2019年3月至2021年3月期间在安徽医科大学附属阜阳医院口腔科就诊的复发性口腔溃疡患者91 例作为观察组。纳入标准：①符合《口腔黏膜病学》［7］中口腔溃疡的诊断标准；②至少3 次口腔溃疡发病史；③年龄≥18 岁；④患者及家属签订知情同意书。排除标准：①合并其他口腔疾病者；②合并急慢性感染疾病者；③重要脏器严重异常者。纳入91 例中，男性53 例，女性38 例；年龄平均（49.83±5.45）岁；病程平均（4.19±1.25）年；体质指数平均（23.07±1.85）kg/m2；文化程度：小学及以下28 例，初中～高中25 例，高中以上38 例；根据病情进展情况分为愈合期49 例和发作期42 例。另选择同期健康体检者80 例作为对照组，其中男性47 例，女性33 例；年龄平均（49.34±7.48）岁；体质指数平均（22.76±1.89）kg/m2。2 组性别、年龄、体质指数和文化程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 口腔菌群检测

1.2.1.1 标本收集：受试者均于禁饮禁食2 h 后，用生理盐水轻微漱口，收集1mL 唾液，用无菌移液器分装500 μL 于无菌EP 管中，置4℃冰箱保存备用。

1.2.1.2 引物设计：应用引物设计软件Primerprimer 5.0 设计链球菌、韦荣氏菌16s rRNA 基因特异性引物（见表1），由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

表1 链球菌、韦荣氏菌的引物序列及产物片段Table 1 Primers and product fragments of Streptococcus and Vironella

1.2.1.3 标本DNA 提取：500 μL 标本中加入十二烷基硫酸钠（10%）87 μL 和蛋白酶K（20 mg/mL）3 μL，振荡混匀，65℃孵育10 min。在混合液中加入NaCl 溶液（5 mol/L）125 μL 和CTAB/NaCl 溶液125 μL，振荡混匀，65℃孵育10 min。在混合液中加入氯仿840 μL，12 000 r/min 离心5 min。将上清液移置另一无菌EP 管中，加入0.6倍体异丙醇，-20℃下静置30 min。12 000 r/min离心30 min，弃上清液，沉淀室温下风干20 min，加入100 μL 灭活超纯水或灭菌TE 重悬，20℃保存备用。

1.2.1.4 实时荧光定量PCR：按照TIANGEN 公司荧光定量PCR 试剂盒操作说明进行操作，取25 μL 反应体系，包括2.5 μL 的10×PCR Buffer，2 μL 的dNTP Mixture，2.5 μL 的DNA 模板，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，0.2 μL 的Taq 酶，16.8 μL 的ddH2O。反应条件：预变性95℃3 min；94℃30 s、55℃30 s、72℃1 min，共30个循环；72℃10 min结束反应。

1.2.2 血炎性因子检测

采集受试者清晨空腹外周静脉血5 mL，以10 cm 半径，3 000 r/min，离心10 min，收集血清，采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-2（Interleukin-2，IL-2）和白介素-8（Interleukin-8，IL-8）水平，人TNF-α ELISA试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司），人IL-2 ELISA 试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司），人IL-8 ELISA 试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司），严格依据试剂盒检测中说明书的内容进行操作。

1.2.3 T 细胞亚群水平检测

采集受试者清晨空腹外周静脉血5 mL，取每份标本100 μL 血分别加入异硫氰基荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的免疫球蛋白G1（Immunoglobulin G1，IgG1），藻红蛋白荧光素（PE）标记的CD3，FTTC 标记的CD4 和FTTC 标记的CD8 各20 μL，充分混匀后，放置于37℃孵育15 min，制备密度为1×105个/mL 的单个核细胞悬液，上美国BD 公司流式细胞仪检测，测定T 细胞亚群水平，采用配套软件CyView 实时获取实验数据，进行分析，计算CD4+/CD8+。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行数据处理，计数资料用n（%）表示，行χ2检验，计量资料用（）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组口腔菌群比较

观察组链球菌和韦荣氏菌的DNA 浓度低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组口腔菌群比较（±s）Table 2 Comparison of oral flora between 2 groups（±s）

表2 两组口腔菌群比较（±s）Table 2 Comparison of oral flora between 2 groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 91 80链球菌DNA 7.93±0.54 9.17±0.68 13.275＜0.05韦荣氏菌DNA 7.10±0.45 8.29±0.54 15.714＜0.05

2.2 两组血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平比较

观察组血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平比较（±s）Table 3 Comparison of serum TNF-α，IL-2 and IL-8 levels between 2 groups（±s）

表3 两组血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平比较（±s）Table 3 Comparison of serum TNF-α，IL-2 and IL-8 levels between 2 groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 91 80 TNF-α（pg/mL）16.74±2.38 9.82±1.86 20.975＜0.05 IL-2（pg/mL）39.74±5.43 21.23±3.28 26.526＜0.05 IL-8（ng/L）76.83±7.65 52.14±5.89 23.403＜0.05

2.3 两组T 细胞亚群比较

观察组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 两组T 细胞亚群比较（±s）Table 4 Comparison of T cell subsets between 2 groups（±s）

表4 两组T 细胞亚群比较（±s）Table 4 Comparison of T cell subsets between 2 groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 91 80 CD3+（%）65.23±3.71 76.72±4.65 17.953＜0.05 CD4+（%）34.38±3.12 40.92±2.97 13.987＜0.05 CD4+/CD8+（%）1.29±0.31 1.82±0.27 11.844＜0.05

2.4 不同病情口腔菌群比较

急性发作期组链球菌和韦荣氏菌DNA 浓度低于愈合期组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 不同病情口腔菌群比较（±s）Table 5 Comparison of oral flora in different conditions（±s）

表5 不同病情口腔菌群比较（±s）Table 5 Comparison of oral flora in different conditions（±s）

组别急性发作期组愈合期组t 值P 值n 49 42链球菌DNA 7.47±0.59 8.36±0.47 7.866＜0.05韦荣氏菌DNA 6.48±0.46 7.76±0.39 14.183＜0.05

2.5 不同病情血炎性因子比较

急性发作期组血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平高于愈合期组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表6 不同病情炎性因子比较（±s）Table 6 Comparison of inflammatory factors in different conditions（±s）

表6 不同病情炎性因子比较（±s）Table 6 Comparison of inflammatory factors in different conditions（±s）

组别急性发作期组愈合期组t 值P 值n 49 42 TNF-α（pg/mL）21.02±2.89 12.07±2.03 16.820＜0.05 IL-2（pg/mL）51.27±6.95 27.38±4.26 19.367＜0.05 IL-8（ng/L）91.28±8.98 61.07±6.20 18.364＜0.05

2.6 不同病情T 细胞亚群比较

急性发作期组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+低于愈合期组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表7。

表7 不同病情T 细胞亚群比较（±s）Table 7 Comparison of T cell subsets in different conditions（±s）

表7 不同病情T 细胞亚群比较（±s）Table 7 Comparison of T cell subsets in different conditions（±s）

组别急性发作期组愈合期组t 值P 值n 49 42 CD3+（%）61.42±3.26 70.82±3.98 12.384＜0.05 CD4+（%）30.96±3.14 37.89±2.97 10.760＜0.05 CD4+/CD8+（%）1.02±0.35 1.59±0.23 9.014＜0.05

3 讨论

流行病学调查显示，复发性口腔溃疡发生率较高，且容易复发［8-9］。口腔菌群的稳定对口腔内环境的稳定性维持尤为重要，通常口腔正常菌群与宿主间保持动态平衡，从而发挥保护宿主作用，若菌群失调，则会损伤宿主而产生相应疾病。唾液菌群（如链球菌、韦荣氏菌等）为口腔黏膜与口腔中的正常菌群［10-11］。研究显示，口腔菌群变化参与了口腔溃疡发生、发展。当唾液菌群中链球菌、韦荣氏菌含量下降时，将不利于口腔黏膜稳定性的维护，故而可导致复发性口腔溃疡的发生［12］。

机体免疫功能维持主要依赖于各种免疫因子、免疫细胞及免疫细胞亚群间的平衡。T 细胞亚群是评价机体免疫功能重要指标，分为CD3+、CD4+和CD8+细胞，所有T 淋巴细胞CD3+均阳性，按功能分为CD4+和CD8+以及调节性T 细胞，而CD4+、CD8+是机体重要的免疫调控细胞，CD4+细胞分为Th1 和Th2 两个细胞亚群，分别介导细胞免疫应答和辅助体液免疫应答。而CD8+细胞主要功能是特异性直接杀伤靶细胞，其能够作为监测机体免疫功能的指标［13-14］。CD4+是诱导性和辅助性T 细胞，是调控免疫反应最重要的枢纽细胞。CD8+是抑制性和细胞毒性T 细胞，是免疫反应中的直接杀伤性细胞。通常情况下，CD4+和CD8+细胞处于平衡状态，而其中CD4+细胞的辅助作用以及CD8+细胞的免疫抑制作用对机体正常免疫功能的维持具有重要作用。而当CD4+/CD8+比值降低时，说明机体免疫功能处于失衡状态，从而容易引起多种疾病［15］。本研究结果说明复发性口腔溃疡患者细胞免疫功能下降，且与患者病情进展密切相关。

炎性因子与口腔溃疡发生、发展密切相关［16］。TNF-α 主要由肥大细胞、巨噬细胞和单核细胞产生的细胞因子，其水平的过度释放是溃疡病的特异性病理因素。TNF-α 能够对中性粒细胞发挥显著的趋化作用，将其趋化至病损部位，发挥显著的免疫细胞调节作用［17］。当TNF-α 介导的炎性反应作用于口腔黏膜上皮时，可导致组织溶解、水肿、破溃。IL-2 是具有多种生物活性的一种细胞因子，主要是Th1 类细胞分泌的一种促炎因子，由活化的CD4+T 细胞分泌。IL-8 作为一种抗炎因子，属炎症和损伤时的主要抗炎因子，同时也是参与复发性口腔溃疡发病的病理过程。在早期口腔溃疡损伤处的炎症细胞、内皮细胞及角化细胞可能分泌大量的IL-8，活化炎症细胞，诱导T 细胞游离到病损处，共同作用，从而形成口腔溃疡［18］。本研究结果说明复发性口腔溃疡患者存在明显炎性反应。

综上所述，复发性口腔溃疡患者存在口腔菌群紊乱，炎性反应及细胞免疫功能紊乱，且与患者病情密切相关。