侯承尧， 徐 通,崔建涛,田润博,郑兰兰，赵 丽，陈红英* (.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 45000；.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046)

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV) 属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种无囊膜、二十面体对称的单股环状DNA病毒，是迄今为止发现的最小的动物病毒之一[1]。根据最新报道PCV可以分为PCV1、PCV2、PCV3和PCV4[2-3]。PCV1对猪没有致病性[4]，而PCV2被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原[5]，不仅可引起PMWS，还与猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪呼吸系统混合疾病(PRDC)、母猪繁殖障碍、增生性坏死性肠炎等疾病密切相关[6]。2015年,美国学者PALINSKI等[7]和PHAN等[8]发现PCV3，随后在中国、韩国和意大利等国家相继报道[9-11]。目前PCV3已经在世界范围内流行，据相关报道PCV3极可能会导致PNDS、PRDC和繁殖障碍等一系列PCV相关疾病(PCVAD)[12]。2019年,ZHANG等[3]在湖南省发现新型PCV，并暂定为PCV4型。PCV4全长为1 770 bp，和其他PCV的同源性为43.2%～51.5%，也包含2个主要的开放阅读框Rep和Cap，且发现PCV4可能与PDNS和PRDC等严重临床疾病相关。

前期研究结果显示，PCV3/4均与PDNS、PRDC相关，且两者的混合感染在我国猪场已经存在，临床诊断难于区分这2种病原体，因此需要建立实验室诊断方法。徐朋丽等[13]、田润博等[14]已经建立了针对PCV3/4单项PCR检测方法，迄今尚无同时检测和区分PCV3/4的PCR检测方法，且单项的PCR检测方法费时费力。因此，本研究旨在建立一种同时检测PCV3/4的双重PCR方法，并对河南、山西省部分地区临床病料进行检测，为这2种病原的临床诊断及流行病学调查提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒株及临床样品根据徐朋丽等[13]、田润博等[14]建立的PCR方法，对实验室保存的疑似PCV感染病料样品分别进行PCV3/4检测、测序，将鉴定为阳性的病料样品用于本试验阳性对照和重组质粒的构建。PCV2、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)均由郑州市猪重大疫病防控重点实验室保存。

2018—2020年采自河南和山西省部分猪场疑似PCV感染的72份猪组织及血清样本，经处理后反复冻融3次，12 000 r/min离心5 min，-80℃保存备用。

1.2 主要试剂UNIQ-10柱式病毒基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Trizol和反转录试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；pMD18-T Vector购自宝生物工程(大连)有限公司；2×Fast Taq Premix 酶、DNA MarkerⅠ、DH5α感受态和微柱浓缩DNA凝胶回收试剂盒均购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.3 引物设计与合成利用DNAStar软件MegAlign程序，对GenBank中已发表的PCV3全基因及其Rep基因序列(MF593110、MH192341、KX966193 KY075989、KY996341、LC383840、MF162298、MH699985、MH607133)，PCV4 Cap基因(MN162710) 及其全基因序列(MK986820)进行比对分析，确定PCV3 Rep基因和PCV4 Cap基因的高度保守区域，利用Primer 5.0软件分别设计1对特异性引物(P1/P2、P3/P4)，预期扩增片段为138，391 bp。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成(表1)。

表1 双重PCR引物信息

1.4 病毒核酸的提取利用UNIQ-10柱式病毒基因组DNA抽提试剂盒提取PCV2、PRV和PPV以及PCV3/4阳性病料样品的基因组DNA，—80℃保存；利用TRIzol法提取PEDV、PRRSV和CSFV的总RNA，并反转录为cDNA，-80℃保存。

1.5 单项PCR扩增及产物的克隆与测序以1.4中提取的PCV3/4基因组DNA为模板，用P1/P2、P3/P4 2对特异性引物分别进行PCV3/4的单项PCR扩增。反应体系均为25 μL：2×Fast Taq Premix 酶 12.5 μL，上、下游引物各为0.5 μL，模板量为3 μL，ddH2O 8.5 μL。PCV3的反应程序为95℃ 5 min；95℃ 25 s、58℃ 25 s、72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 10 min。PCV4的反应程序为95℃ 5 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s，共35个循环；72℃ 10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。将回收纯化的PCR产物与pMD18-T Vector连接，构建重组质粒pMD18-PCV3和pMD18-PCV4，转化至DH5α感受态细胞。将鉴定为阳性的重组质粒送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，经紫外分光光度计测量重组质粒的浓度，并计算其拷贝数，于-20℃保存备用。

1.6 PCV3/4双重PCR方法的建立

1.6.1双重PCR方法条件的优化 在PCV3/4单项PCR方法的基础上，采用方阵试验分别针对退火温度(52～62℃)和时间(20～45 s)、循环数(20～40)、引物比例、模板量对双重PCR方法进行条件优化，确定最佳反应体系和反应程序。

1.6.2双重PCR方法的特异性试验 利用已优化的双重PCR方法，分别对PCV2、PRV、PPV、 PEDV、PRRSV和CSFV核酸进行PCR扩增，同时设立阴性对照，评价建立的双重PCR方法的特异性。

1.6.3双重PCR方法的敏感性试验 将重组质粒pMD18-PCV3和pMD18-PCV4等体积混合，进行10倍梯度稀释(10-1～10-10)后，取混合标准质粒1 μL 做模板，利用已优化的双重PCR方法进行扩增，同时设立阴性对照，评价建立的双重PCR方法的敏感性。

1.6.4双重PCR方法的重复性试验 随机取3份已知的PCV3 和PCV4混合感染的阳性病料样品DNA为模板，利用已优化的双重PCR方法进行PCR扩增，重复3次。间隔1周后再利用此方法检测，共重复3次，从而评价建立的双重PCR方法的重复性。

1.7 临床样品检测利用已优化的双重PCR方法对2018—2020年收集自河南和山西部分地区猪场疑似PCV感染的72份猪组织病料样品进行检测，并与单项PCR检测结果进行对比，评价该双重方法的准确性和临床实用性。

2 结果

2.1 单项PCR扩增结果利用P1/P2、P3/P4 2对特异性引物，分别对PCV3、PCV4阳性病料样品DNA进行单项PCR扩增，结果分别出现大小约130 bp(PCV3)和390 bp(PCV4)的条带(图1)，与预期片段大小相符。测序结果显示，克隆的PCV3片段大小为138 bp，与参考序列(MF593110、KY996341)同源性为98.6%～100.0%；PCV4片段大小为391 bp，与参考序列(MN162710、MK986820)同源性为100.0%；表明单项PCR扩增结果是特异的。

2.2 双重PCR扩增结果及优化通过对反应体系和反应程序的优化，最终确定最佳反应体系为25 μL：2×Fast Taq Premix 酶 12.5 μL，P1/P2各0.6 μL、P3/P4各0.4 μL，模板量为2 μL，ddH2O 8.5 μL。最佳反应程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s，共35个循环。利用已优化的双重PCR方法，对PCV3/4阳性病料样品的混合DNA进行扩增。结果显示，双重PCR方法能同时扩增138 bp(PCV3)和391 bp(PCV4)的2条特异性目的条带(图1)，与预期结果一致，且与2个单项PCR扩增条带相一致。

M.DL1000 DNA Marker;1.PCV3/4双重PCR产物;2.PCV3单项PCR产物;3.PCV4单项PCR产物;4.阴性对照图1 PCV3/4单项及双重PCR扩增结果

2.3 双重PCR方法的特异性试验运用建立的双重PCR方法，分别针对PCV3/4混合DNA、PCV2、PRV、PPV的DNA和PEDV、PRRSV、CSFV的cDNA模板及阴性对照进行PCR扩增。结果显示，仅当PCV3/4混合DNA为模板时，可以有效地扩增出2条特异条带(PCV3的138 bp和PCV4的391 bp)，而以5种常见猪源病毒核酸和阴性对照为模板，无特异性扩增片段(图2)，表明建立的双重PCR方法具有良好的特异性。

M.DL1000 DNA Marker;1.PCV3、PCV4双重 PCR 扩增产物;2～7.PCV2、PRV、PPV、PEDV、PRRSV、CSFV扩增产物;8.阴性对照图2 PCV3/4双重PCR特异性试验

2.4 双重PCR方法的敏感性试验将测序正确的重组质粒经紫外分光光度计测量质量浓度，pMD18-PCV3为231 mg/L(约7.45×1010拷贝/μL)和pMD18-PCV4为305 mg/L(约9.02×1010拷贝/μL)。

将重组质粒pMD18-PCV3和pMD18-PCV4等体积混合，进行10倍梯度稀释(10-1～10-10)，利用双重PCR方法对其进行扩增。结果显示，该双重方法对pMD18-PCV3和pMD18-PCV4的检测极限均到10-9稀释度，PCV3最低检测极限为74.5拷贝/μL，PCV4最低检测极限为90.2拷贝/μL(图3)。

M.DL1000 DNA Marker;1～10.PCV3和PCV4质粒混合后10-1～10-10倍比稀释扩增产物；11.阴性对照图3 双重PCR敏感性试验

2.5 双重PCR方法的重复性试验利用双重PCR方法对随机选取的PCV3、PCV4混合感染的病料DNA进行扩增，并重复3次。随后每间隔1周检测1次，共重复3次。结果显示，均能成功扩增出PCV3/4预期的特异目的片段且阴性对照正常，表明建立的双重PCR方法具有良好的重复性。

2.6 临床样品检测结果采用已优化的双重PCR方法，对实验室2018—2020年采集的临床疑似PCV感染的72份病料样品进行检测。结果显示， PCV3的检出率为58.3%(42/72)； PCV4的检出率为19.4%(14/72)；同时感染PCV3/4的检出率为19.4%(14/72)。双重PCR方法的检测结果与单重PCR方法检测结果符合率为100.0%(表2),表明建立的双重PCR方法准确可靠，可以用于临床检测。

表2 临床样品检测结果 份

3 讨论

PCV3/4均为近年新发现的PCV基因型，两者都可能引起PDNS、PRDC的感染，在临床致病方面还有许多问题亟需深入研究，因此对PCV3/4的检测和监测就显得尤为重要。田润博等[14]已建立了针对PCV4单项的普通PCR检测方法，并且发现广泛存在PCV3/4的混合感染。ZHANG等[15]研究也发现PCV3/4混合感染的病例。针对PCV4，除了单项普通PCR检测方法以外，ZHANG等[3]建立TaqMan荧光定量PCR检测方法，ZHANG等[15]建立SYBR Green 荧光定量PCR检测方法，此方法虽方便快捷、灵敏度高，但成本也较高，不适用于临床上大批量样本的检测和监控，且在临床上无法区分PCV3/4。PCV3/4的单项PCR方法进行检测，费时费力且成本高，而双重PCR技术能够节约成本同时快速检测2种病原。

本研究根据GenBank登录的PCV3/4基因序列，设计了2对特异性引物。引物浓度均为25 μmol/L，因P1/P2引物扩增效率较低，将PCV3/4引物P1/P2和P3/P4的比例调整为6∶4，再对退火温度及时间等进行优化，建立了同时检测PCV3/4的双重PCR。最终确定同时检测PCV3/4的双重PCR最佳条件为：P1/P2各0.6 μL，P3/P4各0.4 μL，退火温度55℃，退火时间30 s，循环次数35个循环。特异性试验结果表明，仅PCV3/4 混合DNA能够扩增出2个片段，而对PCV2、PRV、PPV、PEDV、PRRSV和CSFV核酸均无特异性扩增。PCV3/4的检测极限分别为74.5，90.2 拷贝/μL，略低于XU等[16]建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法对PCV3的检测极限为21.9拷贝/μL，和ZHANG等[15]建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法对PCV4的检测极限为30 拷贝/μL，与徐朋丽等[13]建立的PCV3普通PCR方法和田润博等[14]建立的PCV4普通PCR方法检测极限相当，高于季程远等[17]PCV3检测极限。表明本试验建立的双重PCR方法特异性强和灵敏度高。因此该方法对PCV3/4的临床检测和鉴别诊断有一定的应用价值。

采用建立的PCV3/4双重PCR方法，对2018—2020年河南和山西部分地区的72份疑似PCV病料样品进行检测，PCV3检出率为58.3%，PCV4检出率为19.4%，两者混合感染的检出率为19.4%。XU等[16]报道河南地区PCV3阳性率为31.2%，WANG等[18]报道天津地区PCV3阳性率为37.3%，CHEN等[19]对广东省和广西省的203份病料进行检测，PCV3阳性率高达86.7%。ZHANG等[3]对2017年10月至2019年5月湖南省187份临床样品进行检测，PCV4阳性率为12.8%；ZHANG等[15]对2019年安徽省168份样品进行检测，PCV4阳性率为10.7%；此外，CHEN等[20]在江苏省也发现PCV4。综上所述，PCV3阳性率呈逐年升高趋势，PCV4已在我国大部分地区流行，使养猪业面临着新的挑战，提示应加强对PCV3和PCV4的临床诊断和监测。