李昌安 汪明强 马志勇 李雪平

胃癌(gastric carcinoma，GC)是最常见的恶性胃肠道癌，也是全球第二大癌症相关死亡原因，尽管治疗手段不断改进，但是GC的预后仍然很差[1-2]。跨膜4超家族成员1(Transmembrane-4-L-six-family-1，TM4SF1)，也称为肿瘤相关抗原L6，是一种22 kda的四跨膜结构域蛋白[3]。TM4SF1在各种人类上皮恶性肿瘤(包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌)的质膜和细胞内小泡中异常表达，在正常血管内皮细胞中则高表达[4]。免疫荧光显微镜也显示TM4SF1沉积在细胞质中，并初步存在于培养的内皮细胞和肿瘤细胞的细胞核中。TM4SF1已被证明与肿瘤细胞的生长、运动、侵袭和转移有关。然而，TM4SF1在包括人类胃癌在内的癌症中的确切作用仍不清楚。因此本文选取68例胃癌患者的临床资料进行回顾性分析，探讨TM4SF1水平与胃癌病理特征的相关性，具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2017年5月至2020年4月共收治的68例胃癌患者作为研究对象。纳入标准：经胃镜检查及组织病理学确诊为胃癌；接受紫杉醇、氟尿嘧啶等常规化疗药物治疗；身体状况及血液检查均能耐受化疗；研究经医院伦理委员会批准，患者签字同意。排除标准：胃癌远端转移且不能进行根治性手术；合并其他严重恶性肿瘤；合并心、肝、肾等器官疾病；合并感染性或代谢性疾病；有慢性营养不良史。68例患者中男性39例，女性29例；年龄为42～68岁，平均年龄(54.32±8.92)岁；病程3个月～1年，平均(0.64±0.34)年。

1.2 方法

所有患者均采用胃癌根治术切除病灶组织并作为研究样本，去除结缔组织及坏死组织；并于病灶四周5 cm以外取胃黏膜组织作为癌旁组织样本。TM4SF1染色的免疫组化及定量分析：石蜡包埋切片(4 μm厚)去石蜡切片，再水化，在10 mmol/L柠檬酸钠(pH 6.0)中加热10 min，以回收抗原。内源性过氧化物酶用3%H2O2猝灭。在4 °C下与一级抗体(抗TM4SF1，1∶200，Abcam)孵育后，用辣根过氧化物酶标记的聚合物与二级抗体(Max Vision)于室温下共同孵育15 min后，在二氨基联苯胺中显影并用苏木精轻微复染。阴性对照组除不加原发性抗体外，其余程序均相同。免疫组化结果由两名对临床资料不了解的病理学家独立评估。在×200的条件下，对每个截面进行了5个随机视野检查。肿瘤组织中TM4SF1的表达程度采用分级系统：0分为阴性染色；1分为浅黄色染色；2分为浅棕色染色；3分为深褐色染色。得分0定义为TM4SF1阴性，分数1～3为TM4SF1阳性。

免疫分析法：将均质化的根治性手术前胃癌组织和根治性手术后胃黏膜组织织标本置于RIPA裂解缓冲液中进行裂解。在4 ℃下将裂解物(13 800 g)离心30 min。上清液用于Western blotting分析。用十二烷基硫酸钠(SDS)负载缓冲液变性，在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h后，用兔抗TM4SF1单克隆抗体(1∶1000稀释度，Abcam)或小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶2000稀释度，Sigma-Aldrich)在4 ℃下孵育过夜。在用Tris-缓冲盐水和吐温-20(TBST)洗涤3次，每次10 min后，在室温下用辣根周氧化酶(HRP)结合的小鼠抗兔IgG抗体(1∶2000稀释，Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)探测1 h。用TBST洗涤后，使用化学发光光电表面辣根过氧化物酶试剂盒进行显色并观察，具体显色过程根据试剂盒制造商的相关说明。采用Quantity One软件(Bio-Rad，Hercules，CA)用密度计测量谱带强度。TM4SF1蛋白水平标准化为GAPDH。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 肿瘤组织与癌旁组织TM4SF1表达水平对比

免疫组化分析显示，在GC组织中TM4SF1的阳性表达率为(16.6±3.9)%，显著低于癌旁组织的阳性表达率(57.4±11.0)%，差异有统计学意义(t=8.563，P<0.001)。

2.2 TM4SF1表达与胃癌患者临床病理特征的相关性

TM4SF1阴性患者与TM4SF1阳性患者的性别、年龄、肿瘤大小和侵入深度对比无明显差异(P>0.05)，TM4SF1阴性患者与TM4SF1阳性患者的淋巴结转移、远处转移、肿瘤TNM分期情况对比差异显著(P<0.05)，如表1所示。

表1 TM4SF1表达与胃癌患者的临床病理特征的相关性

2.3 TM4SF1水平与胃癌病理特征相关性分析

Spearman相关分析结果显示：TM4SF1水平与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小和侵入程度无明显相关性(P>0.05)，TM4SF1水平与胃癌患者的淋巴结转移、远处转移和肿瘤TNM分期呈负相关(P<0.05)，如表2所示。

表2 TM4SF1水平与胃癌病理特征相关性分析

3 讨论

跨膜4超家族成员1(TM4SF1)在多种上皮来源的肿瘤中出现异常表达，如胰腺癌、肝癌、结直肠癌等。TM4SF1参与调控肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移等过程，有望成为肿瘤早期诊断、病情预测及预后的指标，因其在恶性肿瘤细胞中选择性表达，也可成为肿瘤靶向治疗的靶点。相关研究显示[5]，USP10、S100A12、p53和Ki67是癌症侵袭和转移的肿瘤分子标志物。还有研究显示[6]，S100A12的表达与侵袭深度有关，并被评估为GC整体生存率差的独立危险因素，p53和Ki67是癌症进展的既定标志物。在目前的研究中[7]，我们发现TM4SF1的表达与胃癌中USP10、S100A12、p53或Ki67的表达没有相关性，这表明TM4SF1在胃癌侵袭转移中起着不同于USP10、S100A12、p53或Ki67的作用。TM4SF1在胃癌侵袭转移中的确切作用值得进一步研究。

相关研究显示[8]，TM4SF1低表达与胃癌的发生发展有关。还有研究显示[9]，胃癌与肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌等不同，胃癌患者的TM4SF1 mRNA和蛋白水平比较低，与本研究相符；TM4SF1在GC组织中呈阴性表达，在相邻非癌组织中呈阳性表达。在我们的患者队列中，免疫组化分析显示，在GC组织中TM4SF1的表达率，显著低于非癌性胃黏膜组织表达率(P<0.05)。相关研究表明[10]，TM4SF1在多种类型的上皮来源恶性肿瘤与供应肿瘤血管内皮呈现低表达状态。还有研究表明[11]，TM4SF1的过表达会促进乳腺癌细胞中MAD-MB-231转移，并且抑制其凋亡情况。Tu，S等研究发现[12]，TM4SF1在侵袭性膀胱癌组织之中表达高于癌旁组织。本研究发现TM4SF1阴性患者与TM4SF1阳性患者的性别、年龄、肿瘤大小和侵入深度对比无明显差异(P>0.05)，TM4SF1阴性患者与TM4SF1阳性患者的淋巴结转移、远处转移、肿瘤TNM分期情况对比差异显著(P<0.05)，由此证明，TM4SF1的丢失对胃癌细胞的侵袭和迁移有促进作用。然而，其他研究表明[13]，TM4SF1的高表达与MIBC(肌肉浸润性膀胱癌)患者的T分期、TNM分期、淋巴结转移状况有关。TM4SF1在肿瘤进展和侵袭中的作用似乎也是组织特异性的。Spearman相关分析结果显示：TM4SF1水平与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小和侵入程度无明显相关性(P>0.05)，TM4SF1水平与胃癌患者的淋巴结转移、远处转移和肿瘤TNM分期呈负相关(P<0.05)，由此证明，TM4SF1可能参与了胃癌的发生发展过程，可以作为胃癌患者治疗和预后情况判断的重要指标。

综上所述，胃癌组织中TM4SF1蛋白水平低于癌旁组织，是GC的抑癌剂，也是胃癌患者的一种新的预测标志物，但其确切作用机制仍有待进一步研究。