贾艳红 刘智慧 魏新朋

食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，全世界每年近一半的新发病例与死亡病例发生在我国[1]。食管癌起病较为隐匿，且早期诊断率低，导致患者就诊时常为晚期[2]，患者常因吞咽困难导致营养不良或肿瘤进展伴发血栓形成导致预后不良的发生[3]。化疗是针对晚期食管癌的有效方法[4]，但缺少化疗效果的评价指标，寻故找与食管癌预后及化疗效果的相关指标具有重要的临床意义。研究发现肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)在多种恶性肿瘤中呈高表达，调控肿瘤细胞增殖转移等生命活动[5]，其高表达常预示患者预后不良的发生[6]。而连接蛋白4(Nectin-4)属于免疫球蛋白黏附分子家族中的一员[7]，在肿瘤细胞侵袭过程中发挥重要作用。TRAF6、Nectin-4促进肿瘤的发生发展，但在食管癌中的作用尚不明确。本研究采用免疫组织化学法及RT-PCR检测技术检测TRAF6、Nectin-4在食管癌组织中的表达水平，旨在为食管癌的化疗效果及预后评估提供相关依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2014年6月至2017年6月本院肿瘤科收治的91例食管癌患者，食管癌诊断、分型依据食管癌诊疗规范(2018版)[8]，患者均经胃镜及影像学检查确诊为食管癌，并依据国际抗癌联合会(UICC)第八版肺癌TNM分期标准[9]将肿瘤分为Ⅰ～Ⅳ期。所有入组患者均为初诊，就诊前未经放、化疗，靶向治疗及生物免疫治疗；患者身体状况良好，无化疗禁忌症，未合并重要脏器功能损伤；患者临床资料完整。91例患者中男性67例、女性24例，年龄48～78(65±8.24)岁。患者组织标本为食管癌根治术中剪取肿瘤中部组织和癌旁正常组织，标本均保存于-80 ℃中。所有研究对象及家属均签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会审核通过。

1.2 化疗方案与疗效评估

食管癌患者均采用一线化疗方案紫杉醇联合铂类进行化疗，注射用紫杉醇(国药准字H20183044，石药集团欧意药业有限公司)用量为：50 mg/m2，于化疗周期第一天静脉滴注；卡铂注射液(波贝，国药准字H20020180，齐鲁制药有限公司)用量为：AUC=2，于化疗周期第一天静脉滴注。7 d为一个治疗周期，共化疗5～6个周期。化疗结束后依据《实体肿瘤治疗反应评价指南》[10]评估化疗效果，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)。采用门诊、电话、微信等方式对患者进行随访，随访间隔3个月，患者出现死亡或截止2020年6月终止随访。

1.3 免疫组织化学法检测TRAF6、Nectin-4的表达

标本采用SP免疫组织化学法试剂盒检测TRAF6、Nectin-4的表达情况。DBA显色后加入苏木精复染，梯度酒精脱水、透明，中性树胶封片，镜下观察。按染色强度记分：无染色0分、浅黄色1分、棕黄色2分、深棕色3分。再按阳性细胞密度打分：高表达细胞<25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。参照文献[11-12]以两项评分相乘获得结果，结果≤6分为低表达，>6分为高表达。TRAF6、Nectin-4一抗均购自美国Abcam公司，HRP标记山羊抗兔二抗、免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。

1.4 RT-PCR技术检测TRAF6、Nectin-4 mRNA水平

采用Trizol法提取肿瘤组织及癌旁组织中总RNA，NanoDrop 2000检测样品合格。采用逆转录PCR一步法试剂盒(美国Thermo Fisher公司)，严格按照说明书所述进行操作。以GAPDH为内参，检测TRAF6、Nectin-4 mRNA的相对表达量。引物均委托上海生工生物公司设计合成，序列为TRAF6 mRNA：F：5’-TCCACACAATGCAAGGAGAA-3’，R：5’-GGGCTTCCAGATGCATAAAA-3’；Nectin-4 mRNA：F：5’-CAAAATCTGTGGCACATT-GG-3’，R：5’-GCTGACATGGCAGACGTAGA-3’。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 肿瘤及癌旁组织中TRAF6、Nectin-4表达情况

免疫组化结果显示：TRAF6、Nectin-4在肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.001)，RT-PCR结果显示：肿瘤组织中TRAF6、Nectin-4 mRNA相对表达量明显高于癌旁组织(P<0.001)，见表1～2。

表1 肿瘤及癌旁组织中TRAF6、Nectin-4表达情况/例

表2 检测肿瘤及癌旁组织中TRAF6、Nectin-4 mRNA相对表达量

2.2 TRAF6、Nectin-4水平与食管癌临床病理特征的关系

结果表明：肿瘤组织中TRAF6、Nectin-4高表达与患者年龄、性别、肿瘤类型及发生部位无关(P>0.05)，但与有无淋巴结转移及肿瘤分期相关(P<0.05)，见表3。

表3 TRAF6、Nectin-4水平与食管癌临床病理特征的关系/例

2.3 TRAF6、Nectin-4水平与化疗效果的关系

患者经化疗后分为CR组14例、PR组31例、SD组27例、PD组19例。各效果组组织中TRAF6、Nectin-4 mRNA水平具有统计学差异(P<0.001)，CR组、PR组患者组织中TRAF6、Nectin-4 mRNA水平明显低于PD组患者(P<0.05)，见表4。

表4 TRAF6、Nectin-4表达水平与化疗效果的关系

2.4 TRAF6、Nectin-4水平与患者预后的关系

截止到2020年6月，91患者中存活47例，死亡41例，失访3例，存活率为51.65%。所有死亡患者均死于肿瘤进展、复发及相关并发症。Kaplan-Meier生存曲线分析显示：组织中TRAF6、Nectin-4高表达患者36个月生存率明显低于低表达患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 组织中TRAF6、Nectin-4水平与患者生存率的关系

3 讨论

本研究通过免疫组化及RT-PCR技术检测TRAF6、Nectin-4在食管癌患者组织中的表达情况，发现食管癌组织中TRAF6、Nectin-4蛋白及mRNA表达水平明显高于癌旁组织。研究表明TRAF6蛋白是肿瘤坏死因子超家族和Toll样受体超家族的重要衔接分子[13]，其活化后可同时激活NF-kB和MAPK通路，促进肿瘤细胞增殖、侵袭，并抑制肿瘤细胞凋亡[14]。

TRAF6还可通过Beclin-1及p62基因参与对肿瘤细胞自噬的调控，在肿瘤耐药中发挥关键作用[15]。另一方面TRAF6蛋白还可作为1种E3泛素连接酶催化形成赖氨酸-63-多聚泛素链，活化UPP途径介导肌蛋白分解引起肌肉萎缩，增加蛋白质的消耗，常导致患者恶病质的发生[16]。研究发现胃癌患者组织中TRAF6高表达与患者肿瘤分期、浸润深度相关，常预示患者预后不良的发生[17]；miR-146a-5p可通过靶向调控TRAF6抑制非小细胞肺癌化疗耐药的发生[18]；而下调卵巢癌细胞中TRAF6的表达能够延缓肿瘤生长速度、促进肿瘤细胞凋亡，并有效提高对化疗药物的敏感性[19]。本研究还结果显示TRAF6在Ⅲ、Ⅳ期食管癌及伴随淋巴结转移的患者组织中呈高表达，提示TRAF6促进肿瘤细胞的发增殖转移，且其高表达与患者化疗效果不佳相关，提示TRAF6参与介导肿瘤耐药的发生，该结果与之前的研究具有一致性，但机制尚不完全明确。

Nectin-4是细胞间粘附系统的重要组成成员，通过形成同顺势二聚体以非Ca2+依赖的形式与E-钙黏素共同维持细胞间粘附的动态平衡[20]。细胞间粘附丧失是肿瘤开始侵袭转移的关键一步，Nectin-4通过活化Rac和Cdc42引起细胞骨架肌动蛋白改变，形成板状伪足和丝状伪足，启动肿瘤细胞浸润和转移[21]。研究表明Nectin-4与乳腺癌转移密切相关，浸润性乳腺癌和肿瘤转移患者组织中Nectin-4呈高表达[22]，在卵巢癌及肺癌组织中也检测出Nectin-4的高表达；国内学者陈君等[23]的研究发现姜黄素能够通过下调Nectin-4的表达抑制了肺癌细胞侵袭和转移的能力。本研究发现Nectin-4在食管癌组织中高表达与肿瘤分期及转移相关，且其高表达患者死亡率较高，提示Nectin-4促进肿瘤细胞侵袭和转移，与先前的研究结果一致。综上所述TRAF6、Nectin-4在食管癌组织中呈高表达，且与患者肿瘤分期及有无淋巴结转移相关，而TRAF6、Nectin-4高表达患者化疗效果通常较差，且死亡率也高于低表达患者。

组织中TRAF6、Nectin-4水平可能作为食管癌患者化疗效果及预后的预测指标发挥临床作用，针对其相关研究将为食管癌的诊断及治疗提供依据，但TRAF6、Nectin-4是否为食管癌转移的必要因素及其促进食管癌发生发展的机制仍需进一步探索。