张伟铮 肖英伦 彭湘明 李松 张轩 陈茶

(1.广州中医药大学第二附属医院/广东省中医院检验医学部，广州 510006；2. 广州市红十字会医院检验科，广州 510220)

播散性毛孢子菌病是一种机会性深部真菌感染性疾病，常感染免疫功能低下人群，可累及皮肤以及肺部等深部脏器[1]。阿萨希毛孢子菌(Trichosporonasahii，T.asahii)是播散性毛孢子菌病主要的致病菌。自国内首例由阿萨希毛孢子菌引起的播散性毛孢子菌病[2]报道以来，其发病率呈明显上升趋势，占深部真菌感染患者的5%～10%[3]。体外药敏试验和临床治疗显示，除了唑类药物外，T.asahii对大多数一线抗真菌药均耐药，一旦造成了系统性的深部感染，病死率可达30%～80%[4]。另外，大部分血液感染阿萨希毛孢子菌的患者处于中性粒细胞缺少期，或是患者普遍接受了介入性器械操作[5]，两者皆有利于生物膜的形成，显著加强T.asahii对抗真菌药物和对宿主免疫系统的抵抗力[6]。因此，临床一线获得高效低毒的新型治疗阿萨希毛孢子菌感染的抗真菌药物需求迫切。肉桂醛作为一种新近发现的能抑制真菌生长的中药单体，尚未见有其对真菌生物膜的形成过程是否存在影响的报道。本研究通过硅胶片构建T.asahii生物膜模型，了解生物膜形成过程的特征，并观察肉桂醛对其生物膜形成过程的影响，更深入地了解该菌的耐药机制，为研发抗毛孢子菌药物提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株T.asahii为实验室保藏的临床分离菌株，共9株，全部通过ITS基因序列分析测序验证。

试剂 沙堡弱培养基，酵母膏、蛋白胨、葡萄糖 (厂家：OXOID)，戊二醛、氯化钙、硝酸银、对苯二酚、硫代硫酸钠、1.05 g/mL肉桂醛(上海生工)，PBS。

材料和仪器 24孔板，硅胶片，细胞计数板，一次性细菌滤过器。VITEK MS质谱仪(法国梅里埃)，恒温摇床(美国Thermo)，DPH-9162型电热恒温培养箱(上海一恒)，生物安全柜(上海力康)，倒置显微镜(日本Nikon)，CX21型光学显微镜(日本Olympus)，移液器。

1.2 方法

VITEK MS质谱仪鉴定临床分离菌株 将测序后保存在-80℃冰箱的T.asahii临床分离株转种于沙堡弱培养基，复苏活化，培养48 h后VITEK MS质谱仪鉴定，复查测序菌种。

T.asahii菌液制备 将T.asahii临床分离株复苏活化后转种于YNB(yeast nitrogen base without amino acids，无氨基酵母氮源)液体培养基中；30℃、150 r/min恒温摇床培养，6000 r/min离心5 min收集沉淀，PBS洗涤3次,剧烈振荡使之形成单个孢子悬液；重悬于YNB培养液中，调整浓度为106CFU/mL。

生物膜体外构建及鉴定 将2 mLT.asahii菌悬液(用分光光度仪测量浓度约为106CFU/mL)加入预先放置1.0 cm×1.0 cm无菌硅胶片的24孔培养板中，28℃培养5 d，设不加T.asahii的空白对照组。倒置显微镜每天观察细菌生物膜的生成情况。分别于1 d、2 d、3 d、4 d、5 d取出培养的硅胶片材料，经灭菌生理盐水多次充分漂洗，去掉浮游菌，银染法染色，光镜下观察。

银染法鉴定生物膜[7]①经灭菌氯化钠注射液多次漂洗, 去掉浮游菌；②在2.5%戊二醛PBS (磷酸盐缓冲液)溶液中固定1 h；③蒸馏水清洗1 min；④饱和CaCl2溶液结合15 min；⑤蒸馏水清洗1 min；⑥5%AgNO3溶液反应15 min；⑦1%对苯二酚溶液显色2 min；⑧蒸馏水漂洗1 min；⑨5%NaS2O3溶液固定2 min；⑩蒸馏水漂1 min。银染后呈黑色,初步可鉴定为真菌生物膜,并以空白孔银染后普通光学显微镜观察结果作阴性对照。

测定不同浓度肉桂醛对T.asahii生长的抑制作用 肉桂醛原液用YNB培养基倍比稀释，稀释后浓度分别为：1050 mg/L、525 mg/L、262.5 mg/L、131.25 mg/L。将倍比稀释后的肉桂醛溶液、T.asahii菌悬液置于无菌的24孔板中，(见表1)。设6组，每组4孔。28℃恒温培养箱培养，用倒置显微镜每天观察变化，实验重复3次。

表1 不同浓度肉桂醛对T. asahii生长的抑制作用实验组设置Tab.1 The inhibitory effects of different concentrations of cinnamaldehyde on T. asahii

测定不同浓度肉桂醛对T.asahii生物膜形成的抑制作用 将肉桂醛原液用YNB培养基倍比稀释，使浓度分别为：1050 mg/L、525 mg/L、262.5 mg/L、131.25 mg/L。将倍比稀释后的肉桂醛溶液、T.asahii菌悬液、灭菌硅胶片置于无菌的24孔板中。共设6组，每组4孔。28℃恒温培养箱培养。分别在培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d时取出硅胶片，经灭菌生理盐水多次充分漂洗，去掉浮游菌，银染法染色，光镜下观察。

2 结 果

2.1 VITEK MS质谱仪鉴定临床分离菌株

-80℃保藏的临床分离株转种于沙堡弱培养基，复苏活化，分离菌株，VITEK MS质谱仪复查临床分离的已测序菌株，经质谱仪鉴定，菌株为阿萨希毛孢子菌(Trichosporonasahii)，置信度达99.9%。

2.2 生物膜体外构建及鉴定

分别取出培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d的硅胶片材料，银染后制片，光学显微镜观察生物膜形成情况。第1天时，银染结果显示硅胶片可见散落的黑点或黑斑，黑斑结构较疏松；第2天时，可见片状黑斑颜色加深，致密程度增加；第3天，生物膜明显增多，形成更加密集，体积更大的团块状，絮状物质；第4天，可见浓厚、絮状黑染膜样物质覆盖，硅胶片透光度降低；第5天，可见黑染细沙状膜样物质覆盖，层次多而致密。见图1。

图1 培养不同天数硅胶表面的T. asahii生物膜。A.培养第1天；B.培养第2天；C.培养第3天 ；D.培养第4天；E.培养第5天 ；F.空白对照Fig.1 T. asahii biofilm culturing on silica gel surface. A. day 1； B. day 2；C. day 3； D. day 4； E. day 5； F. negative

2.3 测定不同浓度肉桂醛对T. asahii生长的抑制作用

将不同浓度的肉桂醛溶液和T.asahii菌悬液置于无菌的24孔板中，28℃恒温培养箱培养，每天在倒置显微镜下观察阿萨希毛孢子菌的生长情况。见图2、3。

图2 不同浓度肉桂醛对T. asahii生长的抑制作用(培养第5天)。 1A～1D.空白对照；2A～2D.阳性对照；3A～3D.肉桂醛浓度131.25 mg/L；4A～4D.肉桂醛浓度262.5 mg/L；5A～5D.肉桂醛浓度525 mg/L；6A～6D.肉桂醛浓度1050 mg/L 图3 不同浓度肉桂醛对T. asahii生长的抑制作用(第1天)。A.阴性对照；B.阳性对照；C.肉桂醛浓度1050 mg/L；D.肉桂醛浓度525 mg/L；E.肉桂醛浓度262.5 mg/L；F.肉桂醛浓度131.25 mg/LFig.2 Inhibition of different concentrations of cinnamaldehyde on the growth of T.asahii (Day 5). 1A-1D. negative; 2A-2D. positive; 3A-3D. cinnamaldehyde 131.25 mg/L; 4A-4D. cinnamaldehyde 262.5 mg/L； 5A-5D. cinnamaldehyde 525 mg/L； 6A-6D. cinnamaldehyde 1050 mg/L Fig.3 Inhibition of different concentrations of cinnamaldehyde on the growth of T.asahii (Day 1). A. negative; B. positive; C. cinnamaldehyde 1050 mg/L; D. cinnamaldehyde 525 mg/L; E. cinnamaldehyde 525 mg/L; F. cinnamaldehyde 131.25 mg/L

2.4 不同浓度肉桂醛对T. asahii生物膜形成的干预

分别取出培养1 d、2 d、3 d的含生物膜的硅胶片材料，银染后制片，光学显微镜4×10倍观察生物膜形成情况。第1天，空白硅胶片整个视野仅可见散落的黑点或黑斑，阳性对照组有大片团块状，细沙状膜样物质覆盖；肉桂醛溶液浓度为1050 mg/L时，硅胶片银染仅可见散落的黑点或黑斑，无膜样物质；肉桂醛溶液浓度为525 mg/L时，硅胶片银染可见小团淡染膜样斑块；肉桂醛溶液浓度为262.5 mg/L时，硅胶片银染可见小片细沙样膜样物质；肉桂醛溶液浓度为131.25 mg/L时，硅胶片银染可见大片细沙状膜样物质。见图4。

图4 不同浓度肉桂醛对T. asahii生物膜形成的干预(第1天)。A.阴性对照；B.阳性对照；C.肉桂醛浓度1050 mg/L；D.肉桂醛浓度525 mg/L；E.肉桂醛浓度262.5 mg/L；F.肉桂醛浓度131.25 mg/LFig.4 Intervention of cinnamaldehyde with different concentrations on the biofilm formation of T.asahii (Day 1). A. negative; B. positive; C. cinnamaldehyde 1050 mg/L; D. cinnamaldehyde 525 mg/L; E. cinnamaldehyde 525 mg/L; F. cinnamaldehyde 131.25 mg/L

第2天，空白硅胶片整个视野仅可见散落的黑点或黑斑，阳性对照组有大片浓厚、絮状黑染膜样物质覆盖；肉桂醛溶液浓度为1050 mg/L时，硅胶片银染后隐约可见分散的小团淡染的细沙状膜样斑块；肉桂醛溶液浓度为525 mg/L时，硅胶片银染可见大块的细沙状膜样斑块；肉桂醛溶液浓度为262.5 mg/L时，硅胶片银染后可见块状膜样物质染色程度加深；肉桂醛溶液浓度为131.25 mg/L时，硅胶片银染后可见大片浓厚、絮状黑染膜样物质覆盖。见图5。

图5 不同浓度肉桂醛对T. asahii生物膜形成的干预(第2天)。A.阴性对照；B.阳性对照；C.肉桂醛浓度1050 mg/L；D.肉桂醛浓度525 mg/L；E.肉桂醛浓度262.5 mg/L；F.肉桂醛浓度131.25 mg/L 图6 不同浓度肉桂醛对T. asahii生物膜形成的干预(第3天)。 A.阴性对照； B.阳性对照； C.肉桂醛浓度1050 mg/L； D.肉桂醛浓度525 mg/L； E.肉桂醛浓度262.5 mg/L； F.肉桂醛浓度131.25 mg/LFig.5 Intervention of cinnamaldehyde with different concentrations on the biofilm formation of T.asahiii (Day 2). A. negative; B. positive; C. cinnamaldehyde1050 mg/L; D. cinnamaldehyde 525 mg/L; E. cinnamaldehyde 525 mg/L; F. cinnamaldehyde 131.25 mg/L Fig.6 Intervention of cinnamaldehyde with different concentrations on the biofilm formation of T.asahii (Day 3). A. negative; B. positive; C. cinnamaldehyde 1050 mg/L; D. cinnamaldehyde 525 mg/L; E. cinnamaldehyde 525 mg/L; F. cinnamaldehyde 131.25 mg/L

第3天，空白硅胶片整个视野仅可见散落的黑点或黑斑，阳性对照组有大片浓厚、絮状黑染膜样物质覆盖；浓度为1050 mg/L时，硅胶片银染后片状淡染的细沙样斑块；浓度为525 mg/L时，硅胶片银染可见大片的膜样斑块，染色程度加深，结构更致密；浓度为262.5 mg/L时，硅胶片银染后可见片状致密的黑染斑块；浓度为131.25 mg/L时，硅胶片银染后可见大片浓厚、絮状黑染膜样物质覆盖。见图6。

3 讨 论

阿萨希毛孢子菌在生长繁殖时能够形成致密的生物膜，当生物膜形成后，显著降低对抗真菌药物的敏感性[6,8]。抑制阿萨希毛孢子菌生物膜的形成可能是防治播散性毛孢子病的重要途经。目前最有效治疗生物膜相关感染的手段主要是抗真菌药物治疗。然而部分报道显示有临床分离株对氟康唑和伏立康唑表现出高抑制浓度，MIC可达32 μg/mL[9]，寻找新的抗真菌药物十分重要。Rossana等[10]证实了丁酸钠能减少毛孢子菌生物膜的形成，并且对其成熟的生物膜有分解作用。Cordeiro等[11]也在研究中指出法尼醇能够在生物膜发育的各个阶段引起毛孢子丝结构的减少。但将二者应用到临床上治疗阿萨希毛孢子菌病还需要进一步的研究。有些传统中药具有抗真菌作用，虽然与抗真菌药物相比抑菌效果较弱，但具有全面调理的作用，不易产生耐药菌株，在治疗真菌感染具有很大的应用前景。

本次实验使用到的肉桂醛是中药肉桂中的重要有效成分，是一种广谱抗真菌中药单体。结果显示，当肉桂醛浓度达到1050 mg/L时，能明显抑制阿萨希毛孢子菌生长和菌相转换，当肉桂醛浓度依次降低时，对阿萨希毛孢子菌的抑制作用也依次降低，孢子、菌丝产生数量依次增多。同时，肉桂醛能延长阿萨希毛孢子菌生物膜的形成、成熟时间。有研究表明，生物膜的形成与菌株的毒力、耐药性以及宿主免疫逃逸机制等方面均有密切联系，而阿萨希毛孢子菌菌丝和关节孢子是构成生物膜的主要结构[12]，这提示肉桂醛可能通过抑制菌丝和关节孢子的产生，进而影响了阿萨希毛孢子菌生物膜的形成，这需要进一步实验验证。

生物膜的形成是引起慢性难治性感染的重要因素之一。生物膜相关感染广泛存在于临床，因此寻找一种简单、可靠的鉴定方法有着重要的临床意义。一般使用扫描电镜(SEM) 观察生物膜的动态变化。激光共聚焦显微镜 (scanning confocal laser microscopy, SCLM) 是目前研究生物膜最理想的手段。但是SEM和SCLM均存在操作繁琐，费用昂贵，不易普及，不能满足临床实际需要。因此，寻找一种简便快速可靠的生物膜形态学观察方法有重要的临床意义。银染法因操作简便，价格低廉被广泛用于实验室常规操作，可用于观察生物膜在药物作用后的变化情况，有较强的特异性和敏感性，能准确反映生物膜在药物治疗前后的动态变化情况 。

本实验通过形态学观察、银染鉴定生物膜形成为中药单体肉桂醛体外抗T.asahii提供了初步的理论依据，中药单体肉桂醛可能成为治疗T.asahii感染的新型抗真菌药物，但尚需更深层次的体外实验、体内实验、临床试验等进一步研究的证实。