李曼芝 朱强 曾继娟 牛锦凤

摘    要：為探索霸王植物叶绿体基因的系统进化，以银川植物园沙生植物种质资源库提供的霸王为试验材料，采用Illumina HiSeq X Ten测序系统对其叶绿体基因组DNA建库测序，借助近缘参考序列，得到霸王的叶绿体全基因组序列，并采用MEGA7软件通过邻接法基于叶绿体全基因组序列对牻牛儿苗科、蒺藜科共20个物种构建系统发育树。结果表明，霸王叶绿体基因组序列全长105 349 bp，包括长单拷贝区79 818 bp、短单拷贝区16 955 bp和2个反向重复序列4 288 bp，共编码97种基因，包括64种蛋白编码基因、29种tRNA基因和4种rRNA，检测到7种重复基因，包括4种蛋白质编码基因和3种tRNA;系统发育树中霸王与蒺藜科四合木的亲缘关系最近，与牻牛儿苗科老鹳草属、老鹳葵属亲缘关系较远。研究结果为进一步开展霸王植物资源的引种驯化提供参考依据。

关键词：霸王;叶绿体基因组;测序与分析

中图分类号：Q941+.2          文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.004

Sequencing and Stuctural Analysis of Chloroplast Genome in Zygophyllum xanthoxylum

LI Manzhi1， ZHU Qiang2，3， ZENG Jijuan2，3， NIU Jinfeng4

（Ningxia Ningmiao Ecological Garden Co.， Ltd.， Yinchuan， Ningxia 750004， China; Ningxia Forestry Institute Co.， Ltd.，Yinchuan， Ningxia 750004， China; State Key Laboratory of Seeding Bioengineering， Yinchuan， Ningxia 750004， China; Ningxia State-owned Forest Farm and Forest Seedling Station， Yinchuan， Ningxia 750004， China）

Abstract： To explore the phylogenetic evolution of chloroplast genes in Zygophyllum xanthoxylum plant， Zygophyllum xanthoxylum provided by the psammophyte germplasm bank of Yinchuan Botanical Garden were used as the material， and Illumina high-throughput sequencing technology was employed to sequence its chloroplast genome. By relative reference sequence， the complete chloroplast genome sequence of Zygophyllum xanthoxylum was obtained. Phylogenetic tree of 20 species belonging to Geraniacea and Zygophyllaceae based on chloroplast genome were constructed using neighbor-joining method through MEGA7 software. The result showed that the chloroplast genome sequence of Zygophyllum xanthoxylum was 105 349 bp in length， including a long single copy region of 79 818 bp， a short single copy region of 16 955 bp and two inverted repeats of 4 288 bp. A total of 97 genes were encoded， including 64 protein-coding genes， 29 tRNA genes and 4 rRNAs. A total of 7 repetitive genes were detected， including 4 protein-coding genes and 3 tRNAs. According to the phylogenetic tree， Zygophyllum xanthoxylum had the closest relationship with Tetraena mongolica， but had the relative farther relationship with Geranium and California which belonged to Geraniacea. The results could provide a reference for the further introduction and domestication of Zygophyllum xanthoxylum plant resources.

Key words： Zygophyllum xanthoxylum; chloroplast genome; sequencing and analysis

霸王（Zygophyllum xanthoxylum），蒺藜科（Zygophy-

llaceae）多浆旱生灌木，是分布于亚洲中部荒漠区的特有种[1]，在维持干旱区脆弱的生态与环境方面具有重要作用[2]。作为我国西北荒漠区植被组成的主要优势种，霸王在漫长的进化过程中形成了独特的适应机制，蕴含着丰富的抗逆基因资源[3]，备受关注。目前，国内外学者已从不同角度对霸王在干旱环境下的适应机理[4-6]、药用成分及生态修复[7]等方面进行了研究。随着研究的不断深入，Khalik等[8]从61种形态特征方面讨论了霸王属植物在蒺藜科的系统位置;Beier等[9]分析了霸王属（Sarcozygium Bunge）与Augea Thunb属、四合木属（Tetraena Maxim）和Fagonia L.之间的关系;我国学者也从分子角度推测了国内一些蒺藜科植物的亲缘关系[10-11]，这些研究主要集中在霸王属的系统位置和属内发育关系，较少涉及霸王物种的系统发育分析。

叶绿体全基因组在种以及种以上较高阶元的系统发育方面有显著的优势，可以作为物种分类的依据。目前，有关叶绿体基因组在霸王种质资源的相关报道较少。本研究以银川植物园沙生植物种质资源库的霸王植物为材料，首次进行叶绿体全基因组测序以及结构和功能基因分析，以期为霸王的系统进化发育研究奠定基础，并对宁夏地区霸王植物资源的育种及引种驯化提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以宁夏银川植物园采摘的霸王叶片为供试材料，叶片采摘后立即放置于保鲜盒，低温避光保存。植物叶绿体基因组DNA提取试剂盒（BTN120308）购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 霸王叶绿体基因组DNA的提取与组装  采用Illumina HiSeq X Ten测序共得到一定数量读长为150 bp的Paired-End Reads，经预估最终组装覆盖率，随机取部分数据用于叶绿体基因组组装。采用参考文献[12]的MITObim v1.9程序，借助近缘参考序列，最终得到本项目霸王样品的叶绿体全基因组序列，通过GenBank现有近缘种叶绿体基因组比对的方式进行注释，利用OGDraw在线工具[13]（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）进行基因组图谱制作。

1.2.2 叶绿体基因组的系统发育分析 选取GenBank现有16种牻牛儿苗科（Geraniacea）和3种蒺藜科植物叶绿体基因组与霸王进行比对，共20个物种的叶绿体基因组进行系统发育分析。借助Geneious R11软件提取单个蛋白质编码基因编码序列并进行比对，选取若干比对效果良好的基因，连接成单个超级基因（supergene），导出至MEGA7软件 [14]构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 基因组组分特征与分析

构建霸王叶绿体基因组物理图谱（图1），分析其叶绿体基因组特征及数量。结果表明，霸王叶绿体基因组呈环状双链，与大多数高等植物叶绿体基因组一样，存在2个反向重复序列（Inverted repeat， IR），即IRA和IRB;反向重复序列之间有一个长单拷贝区（Large single-copy region， LSC）和一个短单拷贝区（Small single-copy region， SSC）。霸王叶绿体基因组全长105  349 bp，其中长单拷贝区（LSC）为79 818 bp，短单拷贝区（SSC）为16 955 bp，反向重复区（IRs）为4 288 bp。

由表1可知，在全基因组中，A+T含量为65.9%，G+C含量为34.1%;长单拷贝区中A+T含量为67.3%，G+C含量为32.7%;短单拷贝区中A+T含量为61.1%，G+C含量為38.9%;反向重复区A中A+T含量为62.5%，G+C含量为 37.5%;反向重复区B中A+T含量为62.6%，G+C含量为37.5%。

通过分析霸王基因组成及内含子情况，由表2可知，霸王共包含97种基因，包括64种蛋白质编码基因，29种tRNA和4种rRNA。其中重复的基因有7种，包括4种蛋白质编码基因，分别是rpl2、 rpl23、rps19、ycf15;3种转运RNA，分别是trnH-GUG、trnI-CAU和trnL-CAA。有11种基因含有内含子，包括6种蛋白质编码基因，其中5种含有1个内含子，分别是atpF*、 clpP*、rpl2*、rpoC1*、rps12* ，另外1种基因含有2个内含子，即ycf3**;5种转运RNA，均含有1个内含子，分别是trnA-UGC*、trnG-UCC*、trnI-GAU*、trnL-UAA*和 trnV-UAC*。此外，86种基因不含有内含子。

2.2 系统发育树的构建

叶绿体基因组对于了解植物进化等具有十分重要的价值[15]。为确定霸王的系统发育关系，本研究采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ），选取牻牛儿苗科、 蒺藜科共20个物种构建霸王的系统进化树（图2），分析确定霸王在植物中的系统进化位置。选择的序列比对总长度为16 677 bp，包含atpB、matK、petA、psaA、psaB、psbC、psbD、rbcL、rpoB和rpoC1这10个基因。从构建的系统进化树中看到，有16个节点的检验分值达到了100%，聚类结果的可靠性比较高，如Geranium、California、Erodium、Monsonia、Pelargonium

等属的物种聚在了一起，表明这些属植物之间的叶绿体相似性较高。同时发现，霸王与四合木（Tetraena mongolica）的亲缘关系最近，其次和团香木属（Larrea）、愈疮木属（Guaiacum）较近，同属于蒺藜科;与牻牛儿苗科老鹳草属（Geranium）、老鹳葵属（California）亲缘关系最远。

3 结论与讨论

植物叶绿体基因组总长度一般约为107～218 kb，其中小单拷贝区长约18～20 kb，大单拷贝区长约81～90 kb，2个反向重复区长约20～30 kb[16]。叶绿体基因组的差异主要由反向重复区的收缩与扩张或者缺失引起[17]，反向重复区在叶绿体基因组架构的稳定和大小方面具有关键作用[18]。本研究通过对霸王叶绿体基因组进行测序与分析，发现霸王叶绿体基因组全长105 349 bp，为环状DNA分子，其中长单拷贝区域（LSC）79 818 bp，短单拷贝区域（SSC）16 955 bp，反向重复区域（IRs）4 288 bp;霸王共编码97种基因，包括64种蛋白编码基因、29种tRNA基因和4种rRNA;IR区中有7种基因，包括4种蛋白质编码基因（rpl2、rpl23、rps19、ycf15）和3种tRNA（trnH-GUG、trnI-CAU、trnL-CAA）。

近年来，植物叶绿体基因组的研究得到国内外许多学者的关注，现已成为叶绿体转化技术和植物亲缘关系鉴定的重要手段之一[19]。目前，有关蒺藜科在分类学上的归属问题存在一定的争议，如《中国植物志》蒺藜科的霸王、四合木均被分类到了蒺藜目[20]，然而在国外的植物学科学研究与教学中被广泛应用的是APG植物分类系统[21]，其将蒺藜科的霸王分类到牻牛儿苗目，而蒺藜科的四合木被分类到了蒺藜目。本研究为确定霸王的进化地位和亲缘关系，选取了牻牛儿苗科（Geraniales） 、蒺藜科（Zygophyllales） 共20个物种叶绿体基因组进行系统发育分析，发现霸王与四合木（Tetraena mongolica）为最近的姐妹种;其次和团香木属（Larrea）、愈疮木属（Guaiacum）较近，同属于蒺藜科;与牻牛儿苗科老鹳草属（Geranium）、老鹳葵属（California）亲缘关系最远。牻牛儿苗属（Erodium）分支和老鹳葵属（California）分支、凤嘴葵属（Monsonia）分支、天竺葵属（Pelargonium）分支聚拢，依次成为姐妹关系，参与牻牛儿苗科植物的组成。

在整个系统树中，亲缘关系较近的同属植物、同属不同种的植物更容易聚在一起，这與传统分类学的结果一致。霸王与四合木的亲缘关系最近，具有相似的遗传背景，研究结果为进一步探索蒺藜科植物的起源、演化以及亲缘关系提供参考，同时为后期引种驯化及种质资源开发利用奠定基础。

参考文献：

[1] 赵一之， 朱宗元. 亚洲中部荒漠区的植物特有属[J]. 云南植物研究， 2003， 25（2）： 113-121， 122.

[2] 宛涛， 史雪松， 伊卫东， 等. 阿拉善荒漠驼蹄瓣属7种植物的花粉形态研究[J]. 西北植物学报， 2006， 26（8）： 1704-1708.

[3] 王文颖. 多浆旱生植物霸王HKT转运蛋白的功能研究[D]. 兰州： 兰州大学， 2019.

[4] 冯燕， 王彦荣， 胡小文. 水分胁迫对幼苗期霸王叶片生理特性的影响[J]. 草业科学， 2011， 28（4）： 577-581.

[5] 耿生莲， 王占林. 霸王、沙木蓼和银水牛果在不同水分条件下的生理研究[J]. 山西林业科技， 2007， 12（4）： 24-26， 30.

[6] 吴斌. 霸王抗旱性的分子机理及相关基因克隆研究[D]. 北京： 中国林业科学研究院， 2006.

[7] 孙安安. 西鄂尔多斯三种强旱生植物在矿区治理中的生理生态适应性[D]. 呼和浩特： 内蒙古大学， 2019.

[8] ABDEL KHALIK K N. A numerical taxonomic study of the family Zygophyllaceae from Egypt[J]. Acta Botanica Brasilica， 2012， 26（1）： 165-180.

[9] BEIER B A， CHASE M W， THULIN M. Phylogenetic relationships and taxonomy of subfamily Zygophylloideae （Zygophyllaceae） based on molecular and morphological data[J]. Plant Systematics and Evolution， 2003， 240（1/4）： 11-39.

[10] 韩燕燕. 基于核糖体ITS和叶绿体trnL-F基因片段的蒺藜科植物分子系统学研究[D]. 乌鲁木齐： 新疆大学， 2007.

[11] 张辰波， 史雪松， 宛涛， 等. 内蒙古驼蹄瓣属植物亲缘关系的RAPD分析[J]. 中国草地学报， 2006， 28（5）： 86-90.

[12] HAHN C， BACHMANN L， CHEVREUX B. Reconstructing mitochondrial genomes directly from genomic next-generation sequencing reads—a baiting and iterative mapping approach[J]. Nucleic Acids Research， 2013，41（13）： e129.

[13] LOHSE M， DRECHSEL O， KAHLAU S， et al. Organellar Genome DRAW—a suite of tools for generating physical maps of plastid and mitochondrial genomes and visualizing expression data sets[J]. Nucleic Acids Research， 2013， 41（Web Server issue）： W575-W581.

[14] KUMAR S， STECHER G， TAMURA K. MEGA7： molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[Z]. Molecular Biology and Evolution， 2016， 33（7）： 1870-1874.

[15] WU M， LAN S， CAI B， et al. The complete chloroplast genome of guadua angustifolia and comparative analyses of Neotropical-Paleotropical bamboos[J]. PLOS One， 2015， 10（12）： e0143792.

[16] DANIELL H， LIN C S， YU M， et al. Chloroplast genomes： diversity， evolution， and applications in genetic engineering[J]. Genome Biology， 2016， 17（1）： 134.

[17] 路东晔， 张磊， 郝蕾， 等. 臭柏叶绿体基因组结构与系统进化分析[J]. 西北植物学报， 2018， 38（8）： 1464-1475.

[18] WANG R J， CHENG C L， CHANG C C， et al. Dynamics and evolution of the inverted repeat-large single copy junctions in the chloroplast genomes of monocots[J]. BMC Evolutionary Biology， 2008， 8： 36.

[19] 赵志常， 高爱平， 黄建峰， 等. 黄皮叶绿体基因组测序与分析[J]. 安徽农业科学， 2019， 47（11）： 115-118.

[20] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志： 第43卷[M]. 北京： 科学出版社， 1997.

[21] 劉文哲， 赵鹏. APGⅣ系统在植物学教学中的应用初探[J]. 高等理科教育， 2017（4）： 104-109.