刘 宁，马洪芳，杨文浩

（开滦总医院1肿瘤科，2外科，3风湿免疫科，河北 唐山 063000）

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病隐匿，且易发生早期转移，5 年生存率不佳[1]。上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞在特定生理、病理情况下转化为间质细胞的现象，被认为是肿瘤转移、侵袭的起始步骤，与恶性肿瘤进程密切相关[2]。近年来多项研究显示，微小RNA（microRNA，miR）参与调控多种恶性肿瘤细胞如结肠癌的增殖、侵袭及迁移等过程[3-5]。miR-195在前列腺癌、胃癌、结肠癌的肿瘤组织或细胞系中表达异常降低，通常作为抑癌基因发挥作用[6-8]。本研究通过体外细胞实验，研究miR-195对结直肠癌细胞EMT 及侵袭的影响，并探讨相关机制，以期为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料正常肠上皮细胞系NCM460、结直肠癌细胞系HCT116，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。miR-195 mimic、NC mimic，由弗元（上海）生物科技有限公司构建。Toll 样受体4/核转录因子κB（toll like receptor 4/nuclear transcription factor κB，TLR4/NFκB）信号 通路 激活 剂 脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS），上海研谨生物科技有限公司。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）试剂盒，上海信裕生物科技有限公司。兔抗人波形蛋白（Vimentin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、TLR4、髓样细胞分化因子88（my‑eloid differentiation factor 88，MyD88）、p50、p65 一抗，购自美国Abcam公司。

Transwell 小室，购自北京优尼康生物科技有限公司。紫外分光光度计，上海谱元仪器有限公司。TURE script One Step qRT-PCR 仪，购自北京百奥莱博科技有限公司。CheniDoc Touch 成像分析系统购自美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NCM460、HCT116 细胞分别培养于1640 培养基、DEME 培养基中，在培养基中补充100 mg/L 链霉素、100 U/mL 青霉素、10% 胎牛血清，标准条件（5% CO2、37 ℃、饱和湿度）。观察到细胞融合度>80% 左右时，0.25% 胰蛋白酶消化、传代，取对数期细胞用于后续实验。