郑延坤 朱丹 王宁

(首都医科大学附属北京同仁医院 1.综合内科;2.老年医学科,北京 100176)

糖尿病是一组以糖代谢异常，血液中葡萄糖水平慢性增高为特征的代谢性疾病，长期持续的高血糖可导致心脑血管疾病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变等并发症，危及患者生命[1]。以往研究认为，胰岛β细胞功能受损导致胰岛素分泌不足或绝对缺乏是糖尿病的主要发病机制，近年来随着对糖尿病发病机制认识的深入，认为胰高血糖素的绝对或相对过多也在糖尿病发病中起重要作用[2]。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是肠粘膜内分泌细胞分泌的一种多肽激素，可通过抑制胰高血糖素的释放同时增加胰岛素分泌，而改善机体对胰岛素的抵抗[3-4]。目前靶向GLP-1的药物已逐渐应用于临床糖尿病的治疗，并取得了一定疗效[5]。黄芩素是中药材黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一，已有研究表明，黄芩素对2型糖尿病大鼠的糖代谢和肾功能具有保护作用[6]。但黄芩素是否影响GLP-1和胰高血糖素的分泌尚不清楚。本研究建立2型糖尿病小鼠模型，观察黄芩素对小鼠GLP-1和胰高血糖素分泌的影响，以期为糖尿病的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取40只8周龄健康C57BL/6J小鼠，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。对实验小鼠的处理符合动物伦理要求，并经医院伦理委员会审核、批准。

1.2 主要试剂 盐酸二甲双胍片，规格0.25 g/片，购自北京京丰制药集团有限公司；黄芩素，纯度≥98%，规格20 mg/支，购自北京华业寰宇化工有限公司；链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)购自北京博爱港生物科技有限公司；小鼠胰岛素酶联免疫吸附检测试剂盒和小鼠胰高血糖素酶联免疫吸附检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；小鼠GLP-1酶联免疫吸附检测试剂盒购自北京方程生物公司；实验用引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

1.3 方法

1.3.1 建立2型糖尿病小鼠模型及分组 40只8周龄的C57BL/6J小鼠适应性饲养1周后，将其随机分为两组：正常饲养组(正常组，10只)和高脂饲养组(30只)。正常组给予普通饲料喂养，高脂饲养组给予高脂饲料喂养，两组小鼠均自由饮水、摄食，4周后给予高脂饲养组小鼠单次腹腔注射STZ 110 mg/kg(称取STZ配成1%的枸橼酸盐溶液)，同时给予正常组小鼠腹腔注射相应体积的枸橼酸盐缓冲液，分别于注射3 d和7 d时，将小鼠禁食12 h于次日清晨尾尖采血，测小鼠空腹血糖(Fasting blood-glucose,FBG)值，模型组小鼠空腹血糖值均≥11.1 mmol/L则提示2型糖尿病小鼠模型建立成功。将30只造模成功的2型糖尿病小鼠再随机分为3组：模型组、二甲双胍组和黄芩素组，每组各10只。二甲双胍组给予二甲双胍0.30 g/kg灌胃，黄芩素组给予黄芩素250 mg/kg灌胃，正常组和模型组则给予等量的生理盐水灌胃，每天灌胃1次，连续灌胃6周。

1.3.2 检测指标 分别于灌胃开始前和灌胃结束后，小鼠禁食12 h,尾尖采血，使用血糖仪测定空腹血糖(FBG)和餐后2 h血糖值(2 h PBG)，采用酶联免疫吸附实验测定空腹胰岛素和胰高血糖素；另取血样于干燥肝素试管中，迅速加入20 μL二肽基肽酶Ⅳ抑制剂，置于离心机中以3000 r/min离心10 min,取上层血清，采用酶联免疫吸附法测定血清中GLP-1水平。

1.3.3 小鼠回肠组织中胰高血糖素原(proglucagon,PG)和前激素转化酶(PC1/3)基因表达检测 各组小鼠灌胃6周后，每组选取5只小鼠处死，取回肠组织。采用TRIzol试剂法提取组织总RNA,紫外分光光度计检测提取RNA样品的浓度和质量。参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应合成cDNA。利用ABI实时荧光定量PCR系统进行定量PCR反应，反应程序：94 ℃，5 min;94 ℃，30 s、59 ℃，30 s、72 ℃，30 s,共35个循环；72 ℃，5 min。引物序列：PG正向5′-G TAATGCTGGTACAAGGCAG-3′，反向5′-TTATA AAGTCCCTGGCGGCA-3′；PC1/3正向5′-CGCTG ACCTGCACAATGACT-3′，反向5′-CAGACAACCA GGTGCTGCAT-3′；GAPDH正向5′-GCTGAGAAG CCCAAGCTTGT-3′，反向5′-TCTCCATGGTGGTG AAGACG-3′。结果以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算组织中PG和PC1/3 mRNA相对表达水平。

1.3.4 腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT) 各组小鼠灌胃6周后，每组选取5只，禁食15 h(自由饮水)后，给予500 mg/kg的葡萄糖腹腔注射，分别于注射后0、30、60、120 min采集尾尖静脉血，测定血糖和胰高血糖素。

2 结果

2.1 各组小鼠给药前后FBG和2 h PBG比较 给药前，模型组、二甲双胍组和黄芩素组FBG和2 h PBG均显著高于正常组 (P<0.05)；给药后，与模型组比较，二甲双胍组和黄芩素组FBG和2 h PBG均显著降低 (P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠给药前后FBG和2 h PBG比较Table 1 Comparison of FBG and 2 h PBG before and after administration

2.2 各组小鼠给药前后胰岛素和胰高血糖素比较 给药前，与正常组比较，模型组、二甲双胍组和黄芩素组胰岛素水平均显著降低 (P<0.05)，胰高血糖素水平均显著升高 (P<0.05)；给药后，与模型组比较，二甲双胍组和黄芩素组胰岛素水平均显著升高(P<0.05)，胰高血糖素水平均显著降低 (P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠给药前后胰岛素和胰高血糖素比较Table 2 Comparison of insulin and glucagon between groups before and after administration

2.3 各组小鼠给药前后血清GLP-1比较 给药前，与正常组比较，模型组、二甲双胍组和黄芩素组血清中GLP-1水平均显著降低 (P<0.05)；给药后，与模型组比较，二甲双胍组和黄芩素组血清中GLP-1水平均显著升高 (P<0.05)。见表3。

2.4 各组小鼠回肠组织中PG和PC1/3 mRNA相对表达水平比较 给药后，与正常组比较，模型组小鼠回肠组织中PG mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，PC1/3 mRNA相对表达量显著下降(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组和黄芩素组小鼠回肠组织中PG 、PC1/3 mRNA相对表达量均明显上升 (P<0.05)。见表4。

表4 PG和PC1/3 mRNA相对表达水平比较Table 4 Comparison of relative mRNA expression levels of PG and PC1/3

2.5 各组不同时间点血糖和胰高血糖素水平比较 葡萄糖注射后0、30、60、120 min,模型组血糖和胰高血糖素均显著高于正常组 (P<0.05)，二甲双胍组和黄芩素组血糖和胰高血糖素均显著低于模型组 (P<0.05)。见表5。

表5 各组不同时间点血糖和胰高血糖素水平比较Table 5 Comparison of blood glucose and glucagon levels in each group at different time points

3 讨论

黄芩素是传统中药黄芩发挥功效的主要活性成分，研究表明黄芩素对糖尿病及其并发症的治疗具有显著疗效，如黄芩素通过抑制NF-kB活性、减少尿白蛋白等，延缓早期糖尿病肾病的进展；通过抑制p38 MAPK通路、抗氧化应激等途径，延缓糖尿病周围神经病变的发生[7-8]。本研究发现黄芩素灌胃给药6周能够有效降低2型糖尿病小鼠的FBG和2 h PBG水平，效果与二甲双胍一致。

胰高血糖素是由胰岛α细胞分泌的一种多肽类激素，作为胰岛素的拮抗激素，其主要作用机理是通过促进糖异生和糖原分解过程，调控血糖的升高，为糖尿病治疗提供的新的方向[9-10]。本研究结果提示，黄芩素灌胃给药6周后，2型糖尿病小鼠血液中胰岛素水平明显升高，而胰高血糖素水平明显降低，说明黄芩素能够抑制糖尿病小鼠的胰高血糖素分泌。GLP-1由胰高血糖素原基因表达，在胰岛α细胞中，胰高血糖素原基因的主要表达产物是胰高血糖素，而在肠黏膜的L细胞中，PC1/3将胰高血糖素原剪切为GLP-1[11-13]。GLP-1的主要生理作用是通过抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，同时刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，以达到降低血糖的目的[14-15]。本研究中，黄芩素灌胃给药后，2型糖尿病小鼠血清中GLP-1水平明显升高，检测小鼠回肠组织中胰高血糖素原基因和PC1/3基因表达，发现黄芩素处理后小鼠回肠组织中胰高血糖素原基因和PC1/3基因表达明显上调，提示黄芩素能够促进糖尿病小鼠GLP-1的分泌。王森[16]研究表明，GLP-1缺乏可能是糖尿病患者胰岛素分泌过少，胰高血糖素分泌过多的重要因素。提示黄芩素对2型糖尿病小鼠胰岛素和胰高血糖素的调节作用可能与促进肠粘膜细胞分泌GLP-1有关。

葡萄糖耐量是指机体对血糖浓度的调节能力[17]。正常生理状态下，进餐后血糖浓度升高可刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，维持血糖在稳定范围；然而糖尿病患者的葡萄糖耐受能力降低，存在胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗可引起胰岛α细胞分泌胰高血糖素增多，导致血糖进一步升高[18-19]。本研究通过葡萄糖耐受实验评估黄芩素对2型糖尿病小鼠胰高血糖素动态分泌功能的影响，结果与模型组小鼠比较，黄芩素组小鼠在葡萄糖注射后0、30、60、120 min的胰高血糖素分泌均明显降低，与二甲双胍作用效果一致。提示黄芩素可通过降低糖尿病小鼠糖负荷后胰高血糖素分泌来改善血糖水平，其作用也可能与促进肠粘膜细胞分泌GLP-1有关。

4 结论

黄芩素能够通过调控2型糖尿病小鼠GLP-1和胰高血糖素的分泌，改善糖代谢紊乱。为黄芩素用于临床糖尿病的治疗提供了新的实验依据。