老鸦糊乙酸乙酯部位化学成分及其抗炎活性

2021-10-26吴中含易侨祺张桃莉王红刚

中成药 2021年10期

徐凡，吴中含，易侨祺，张桃莉，赵璐，王红刚

(广东药科大学中药学院，广东广州 510000)

老鸦糊CallicarpagiraldiiHesse ex Rehd.，又名紫珠、小米团花、鱼胆等，为马鞭草科紫珠属的一种小灌木，多生长于海拔200～3 400 m的疏林和灌木丛中，在陕西、甘肃(南部)以及南方大部分地区都有较为广泛的分布，是我国所特有的一种紫珠属植物[1]，老鸦糊资源丰富，应用历史悠久，常用于跌打损伤及各种炎症和出血证的治疗，疗效显著，多部地方典籍亦有收录阐述。《福建民间草药》言其味苦、性辛温，功能驱风除湿、杀虫解毒、散结化瘀，治疗跌打损伤、关节炎、冻疮、蛇伤、皮下出血等效果甚佳。《浙江民间常用草药》记载其性凉、味涩，功能收敛止血、祛风除湿，常用于治疗内外伤出血、尿血等各种出血症。《贵州民间草药》有老鸦糊性微寒、味辛，功能祛风除湿、散瘀解毒的记载，常用于治疗小米丹(裤带疮)、血崩等症。杨勇等[2]对老鸦糊进行了系统的化学成分预实验研究，初步发现老鸦糊根、茎、叶的化学成分基本相同，可能含有有机酸、糖类、酚类、鞣质等化学成分。蒋惠娣等[3]在对包括老鸦糊在内的6种紫珠属植物做大鼠脏器体外孵育时自动发生脂质过氧化的抑制实验时发现老鸦糊几乎无抑制作用，表明老鸦糊在此实验条件下不具备体外抗氧化作用。本课题组前期从老鸦糊中分离得到21个化合物[4]，均为首次从该植物中分离得到，其中生物碱及酰胺类化合物为首次从紫珠属植物中分离得到。

当前有关老鸦糊的研究主要集中在生药学方面，整体仍处于一个较为初级和浅显的阶段，在研究广度和深度方面都存在明显不足。本课题对老鸦糊甲醇提取物的乙酸乙酯部位进行化学成分研究并对部分单体化合物进行抗炎活性筛选，以期对明晰老鸦糊化学成分组成和相关药效物质基础，以及进一步开发老鸦糊药用资源提供参考。

1 材料

AVANCEIII 500 MHz核磁共振仪(瑞士布鲁克拜厄斯宾公司)；半制备高效液相色谱仪(北京赛谱锐思科技有限公司)；maXis impact质谱仪(德国Bruker公司)；二氧化碳培养箱、离心机、低温离心机、高压灭菌锅(广州飞迪生物有限公司)；-80 ℃冰箱(中美科菱低温科技股份有限公司)；超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；细胞培养摇床(天津市欧诺仪器仪表有限公司)；分析天平(十万分之一，上海民桥精密科学仪器有限公司)。硅胶(100～200、200～300目，青岛海洋化工有限公司)；MCI(三菱化学公司)；ODS(日本YMC公司)；Sephadex LH-20(北京赛谱锐思科技有限公司)。石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；硫酸(广州化学试剂厂)；无水乙醇、氯仿(分析纯；天津市致远化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，瑞典欧普森试剂公司)；蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；磷酸缓冲盐溶液(PBS)(美国HyClone公司)；二甲基亚砜(德国Biofroxx公司)；磺胺、N-1-萘乙二胺盐酸盐(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；布洛芬、脂多糖(LPS)(美国Sigma公司)；浓磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；亚硝酸钠(天津市大茂化学试剂厂)。

老鸦糊(28 kg)采自云南省临沧市永德县亚练乡，经中国科学院华南植物园叶华谷教授鉴定为马鞭草科紫珠属植物老鸦糊CallicarpagiraldiiHesse ex Rehd.的枝叶，凭证标本存放于广东药科大学中药标本馆。

2 提取与分离

28 kg老鸦糊阴干后粉碎为粗粉，甲醇冷浸提取5次(前2次48 h，后3次72 h)，每次30 L，合并提取液，减压回收溶剂得到浸膏840 g。浸膏加水(约1∶1)分散均匀，用乙酸乙酯(5×1.2 L)萃取，合并萃取液并减压浓缩，得到乙酸乙酯部位浸膏102 g。

以适量甲醇溶解乙酸乙酯部位(102 g)，加入等量硅胶搅拌均匀，挥干溶剂后干法上样。以硅胶为固定相，以二氯甲烷-甲醇(100∶1、100∶2、100∶3、100∶5、100∶7、100∶9、9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1)梯度洗脱，经薄层色谱检测合并相同馏分得到E1～E12共12个组分。E3组分以凝胶为固定相，以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，经薄层色谱合并相同馏分得到10个组分，后经硅胶柱、凝胶柱、ODS柱、MCI柱及半制备HPLC分离纯化后得化合物1(11.3 mg)、2(5.4 mg)、3(6.1 mg)、4(9.3 mg)、5(9.6 mg)；E5组分先后经硅胶柱、凝胶柱、MCI柱洗脱分离得化合物6(6.3 mg)、7(7.5 mg)；E8组分经凝胶柱以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱后，经半制备HPLC纯化得化合物8(10.4 mg)；E9组分经凝胶柱以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱后，经半制备HPLC纯化得化合物9(13.5 mg)、10(7.1 mg)；E11组分经凝胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱后经薄、层色谱合并相同馏分得到5个组分，后经硅胶柱、凝胶柱、MCI柱及半制备HPLC分离纯化后得化合物11(8.9 mg)、12(6.3 mg)；E12组分经凝胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱后重结晶得化合物13(9.6 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色针状结晶，C30H49O，ESI-MSm/z：425.9[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.69(1H，s，H-29a)，4.57(1H，s，H-29b)，1.68(3H，s，H-30)，1.07(6H，s，H-24，26)，1.02(3H，s，H-23)，0.95(3H，s，H-27)，0.93(3H，s，H-25)，0.79(3H，s，H-28)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：218.3(C-3)，151.0(C-20)，109.5(C-29)，55.1(C-5)，49.9(C-9)，48.4(C-18)，48.1(C-19)，47.5(C-4)，43.1(C-14)，43.1(C-17)，40.9(C-8)，40.1(C-22)，39.8(C-2)，38.3(C-13)，37.0(C-10)，35.7(C-16)，34.3(C-1)，33.7(C-7)，30.0(C-21)，27.6(C-15)，26.8(C-23)，25.3(C-12)，21.6(C-11)，21.2(C-24)，19.8(C-6)，19.5(C-30)，18.2(C-28)，16.1(C-25)，15.9(C-26)，14.6(C-27)。以上数据与文献[5]基本一致，故鉴定为羽扇豆酮。

化合物2：白色无定形粉末，C30H48O4，ESI-MSm/z：471.8[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.17(1H，s，H-12)，3.34(1H，s，H-3)，2.74(1H，d，J=1.9 Hz，H-18)，1.09(3H，s，H-27)，0.92(6H，s，H-23，24)，0.88(6H，s，H-25，26)，0.70(3H，s，H-29，30)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：178.6(C-28)，143.9(C-13)，121.4(C-12)，82.2(C-3)，67.1(C-2)，54.7(C-5)，47.1(C-9)，46.8(C-1)，45.7(C-19)，45.4(C-17)，41.7(C-14)，41.3(C-18)，40.1(C-8)，38.9(C-4)，37.6(C-10)，33.3(C-21)，32.8(C-7)，32.3(C-29)，32.1(C-22)，30.4(C-23)，29.8(C-20)，27.1(C-15)，25.6(C-27)，23.4(C-16)，23.3(C-30)，22.4(C-11)，18.0(C-6)，17.1(C-24)，16.9(C-26)，16.3(C-25)。以上数据与文献[6]基本一致，故鉴定为2α-羟基齐墩果酸。

化合物3：白色无定形粉末，C30H48O4，ESI-MSm/z：471.8[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.00(1H，s，-COOH)，5.14(1H，s，H-12)，4.02(1H，d，J=4.2 Hz，H-2)，3.90(1H，d，J=6.5 Hz，H-3)，3.42(1H，s，H-2)，2.74(1H，dd，J=12.6，1.9 Hz，H-3)，2.11(1H，d，J=10.1 Hz，H-18)，1.04(3H，s，H-24)，0.90(3H，s，H-26)，0.82(3H，s，H-29)，0.74(3H，s，H-25)，0.71(3H，s，H-30)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：178.3(C-28)，138.2(C-13)，124.5(C-12)，82.2(C-3)，67.1(C-2)，54.7(C-5)，52.4(C-18)，47.1(C-9)，47.0(C-1)，46.8(C-17)，41.1(C-14)，40.8(C-8)，38.9(C-4)，38.5(C-19)，38.4(C-20)，37.6(C-10)，36.3(C-22)，32.6(C-7)，31.3(C-21)，29.0(C-23)，27.5(C-15)，23.8(C-16)，22.9(C-11)，22.9(C-27)，22.1(C-30)，18.0(C-6)，17.2(C-24)，17.0(C-26)，16.9(C-29)，16.4(C-25)。以上数据与文献[7]基本一致，故鉴定为2α-羟基乌苏酸。

化合物4：白色粉末状固体，C30H50O，ESI-MSm/z：426.3[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.26(1H，t，J=3.7 Hz，H-12)，3.16(1H，dd，J=11.4，4.8 Hz，H-3)，1.18(3H，s，H-23)，0.99(3H，s，H-24)，0.96(3H，s，H-25，26，27)，0.92(3H，s，H-28)，0.84(3H，s，H-29)，0.79(3H，s，H-30)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：145.3(C-13)，123.8(C-12)，79.7(C-3)，56.8(C-5)，47.7(C-9)，47.3(C-19)，47.3(C-17)，42.9(C-14)，42.8(C-18)，40.6(C-8)，39.8(C-1)，39.8(C-4)，38.2(C-10)，34.9(C-21)，34.0(C-29)，33.9(C-7)，33.6(C-22)，31.6(C-20)，31.6(C-28)，28.9(C-23)，28.7(C-15)，27.9(C-2)，26.4(C-27)，24.5(C-30)，24.1(C-16)，24.0(C-11)，19.5(C-6)，16.3(C-24)，15.9(C-25)，17.8(C-26)。以上数据与文献[8]基本一致，故鉴定为3β-hydroxy-olean-12-en。

化合物5：无色固体，C24H38O4，ESI-MSm/z：391.8[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.74(2H，dd，J=5.8，3.4 Hz， H-3, 6)，7.55(2H，dd，J=5.8，3.3 Hz，H-4，5)，4.34(4H，m，H-1′，1″)，1.74(2H，m，H-2′，2″)，1.47(16H，m，8×CH2)，0.99(6H，m，H-b′，b″)，0.90(6H，t，J=7.2 Hz，H-7′，7″)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：167.9(C=O)，132.5(C-1，2)，131.1(C-3，6)，129.0(C-4，5)，65.7(C-1′，1″)，32.1(C-2′，2″)，30.7(C-3′，3″)， 29.9(C-4′，4″)，29.5(C-5′，5″)，22.9(C-6′，6″)，19.3(C-a′，a″)，14.3(C-7′，7″)，13.9(C-b′，b″)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸二-(2-乙基)己酯。

化合物6：白色粉末状结晶，C30H48O3，ESI-MSm/z：455.4[M-H]-。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.22(1H，t，J=7.4 Hz，H-12)，3.13(1H，dd，J=11.1，3.7 Hz，H-3)，2.84(1H，dd，J=14.3，4.6 Hz，H-18)，1.15、0.95、0.94、0.93、0.83、0.80、0.76(each 3H×7，s，H-23，24，25，26，27，29，30)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：181.9(C-28)，145.2(C-13)，123.6(C-12)，79.7(C-3)，56.8(C-5)，49.1(C-9)，47.7(C-17)，47.3(C-19)，42.9(C-14)，42.8(C-18)，40.6(C-8)，40.4(C-4)，40.0(C-1)，38.2(C-10)，34.9(C-21)，34.0(C-7)，33.8(C-22)，33.6(C-29)，31.6(C-20)，28.9(C-15)，28.8(C-23)，27.9(C-2)，26.4(C-27)，24.5(C-16)，24.1(C-11)，24.0(C-30)，19.5(C-6)，17.7(C-26)，16.3(C-24)，16.0(C-25)。以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为齐墩果酸。

化合物7：白色针状或粉末状固体，C10H10O3，ESI-MSm/z：178.3[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.60(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)，7.52(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，6′)，6.93(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，6.30(1H，d，J=15.9 Hz，H-2)，3.81(3H，m，-OCH3)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：146.3(C-4′)，146.3(C-3)，130.9(C-2′，6′)，128.4(C-1′)，116.6(C-2)，115.4(C-3′, 5′)，55.9(-OCH3)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为4′ -methoxy cinnamic acid。

化合物8：黄色油状液体，C20H26O4，ESI-MSm/z：331.9[M-H]-。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.07(1H，d，J=2.2 Hz，H-14)，7.73(1H，dd，J=8.3，2.3 Hz，H-12)，7.43(1H，d，J=8.4 Hz，H-11)，2.80(1H，dd，J=17.7，14.2 Hz，H-6a)，2.65(1H，dd，J=14.2，3.2 Hz，H-5)，2.37(1H，dd，J=17.7，3.2 Hz，H-6b)，1.92～1.72(4H，m，H-1，2)，1.58(2H，m，H-3)，1.52(6H，d，J=0.9 Hz，H-16，17)，1.34(3H，s，H-19)，1.28(3H，s，H-20)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：200.8(C-7)，181.2(C-18)，155.6(C-9)，149.3(C-13)，132.3(C-12)，131.3(C-8)，124.9(C-11)，124.1(C-14)，72.6(C-15)，47.5(C-4)，45.5(C-3)，38.9(C-6)，38.6(C-10)，38.5(C-1)，37.9(C-5)，31.7(C-16)，31.7(C-17)，23.8(C-20)，19.2(C-2)，16.8(C-19)。以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为7-oxo-15-hydroxydehydroabietic acid。

化合物9：淡黄棕色油状物，C16H22O4，ESI-MSm/z：279.7[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.74(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-2，5)，7.63(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-3，4)，4.08(4H，d，J=6.6 Hz，H-1′，1″)，2.04(2H，m，H-2′，2″)，1.01(12H，d，J=6.7 Hz，H-3′，3″，4′，4″)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：169.3(C-7，8)，133.6(C-1，6)，132.4(C-3，4)，129.9(C-2，5)，72.9(C-1′，1″)，29.0(C-2′，2″)，19.5(C-3′，3″，4′，4″)。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸异二丁酯。

化合物10：黄色油状物，C19H36O2，ESI-MSm/z：295.9[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.35(2H，t，J=4.9 Hz，H-9，10)，3.65(3H，s，H-1′)，2.31(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，2.04(4H，m，H-8，11)，1.33(20H，m)，0.90(3H，t，J=7.0 Hz，H-18)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：176.0(C-1)，130.8(C-9)，130.8(C-10)，51.9(C-1′)，34.8(C-2)，33.1(C-16)，30.8(C-7)，30.8(C-15)，30.7(C-6)，30.7(C-14)，30.6(C-13)，30.5(C-5)，30.4(C-12)，30.2(C-4)，28.1(C-8)，28.1(C-11)，26.0(C-3)，23.7(C-17)，14.4(C-18)。以上数据与文献[14]基本一致，故鉴定为(Z)-9-十八碳烯酸甲酯。

化合物11：白色粉末状固体，C30H47O6，ESI-MSm/z：503.3[M-H]-。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.32(1H，t，J=3.7 Hz，H-12)，3.69(1H，ddd，J=11.1，9.5，4.4 Hz，H-2)，3.50(1H，d，J=11.1 Hz，H-23a)，3.36(1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，3.27(1H，d，J=11.1 Hz，H-23b)，3.25(1H，d，J=4.7 Hz，H-19)，3.06(1H，s，H-18)，1.31(3H，s，H-27)，1.02(3H，s，H-25)，0.96(3H，s，H-30)，0.94(3H，s，H-29)，0.77(3H，s，H-26)，0.70(3H，s，H-24)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：182.5(C-28)，144.8(C-13)，124.7(C-12)，82.5(C-19)，78.3(C-3)，69.7(C-2)，66.5(C-23)，49.1(C-9)，48.4(C-5)，47.7(C-1)，46.7(C-17)，45.2(C-18)，44.1(C-4)，42.7(C-14)，40.7(C-8)，39.2(C-10)，36.0(C-20)，34.0(C-7)，33.4(C-22)，29.5(C-15)，29.4(C-21)，28.7(C-29)，28.6(C-16)，25.2(C-27)，25.1(C-30)，24.9(C-11)，19.3(C-6)，17.8(C-26)，17.4(C-25)，13.8(C-24)。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定为2α, 3β, 19α, 23-四羟基-齐墩果酸。

化合物12：白色针状结晶或无定型粉末，C6H5NO2，ESI-MSm/z：123.0[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：9.03(1H，s，H-6)，8.70(1H，d，J=4.9 Hz，H-2)，8.30(1H，ddd，J=8.0，2.2，1.6 Hz，H-4)，7.56(1H，ddd，J=7.9，4.9，0.8 Hz，H-3)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：169.8(-C=O)，152.9(C-2)，149.5(C-6)，137.3(C-4)，131.5(C-5)，125.1(C-3)。以上数据与文献[16]基本一致，故鉴定为烟酸。

化合物13：白色方晶，C20H30O3，ESI-MSm/z：317.9[M-H]-。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.88(1H，dd，J=17.6，10.9 Hz，H-15)，5.68(1H，dd，J=4.7，2.1 Hz，H-7)，5.14(1H，dd，J=10.9，1.2 Hz，H-16a)，5.10(1H，dd，J=17.6，1.2 Hz，H-16b)，3.68(1H，s，H-14)，1.25、0.88、0.87(each 3H，s，-CH3)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：184.0(C-18)，146.5(C-15)，137.1(C-8)，127.4(C-7)，113.9(C-16)，79.5(C-14)，47.1(C-9)，46.3(C-4)，44.6(C-5)，41.1(C-13)，38.8(C-1)，36.9(C-3)，34.8(C-10)，27.4(C-12)，25.3(C-6)，22.2(C-17)，19.3(C-11)，18.1(C-2)，17.3(C-19)，15.2(C-20)。以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定为calliphyllin。

4 抗炎活性筛选

本实验采用MTT法测定RAW264.7细胞在不同浓度化合物环境下的存活率，来判断对应化合物的细胞毒性作用。采用LPS诱导的RAW264.7生成NO模型，来评价化合物6～8的抗炎活性，以地塞米松为阳性药，将处于对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW 264.7稀释并接种于96孔板，每孔100 μL，密度4×104/mL，孔板边缘加入100 μL PBS，培养24 h，将不做处理的完全培养基正常培养的细胞作为空白组，仅加入100 ng/mL LPS的细胞作为模型组，0.5 μmol/mL地塞米松+100 ng/mL LPS作为阳性组，不同浓度化合物+100 ng/mL LPS作为实验组，加入药物后培养18 h，取各组细胞上清液，以Griess法检测NO释放量，设置复孔5个，重复3次。细胞毒性实验结果见图1，化合物6～8对RAW 264.7细胞NO释放量的影响见图2。