方慧祥

(曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000)

利胆片收载于2020年版《中国药典》中，由大黄、金银花、金钱草、木香、知母、大青叶、柴胡、白芍、黄芩、芒硝、茵陈11味中药加工而成，具有疏肝止痛、清热利湿之功效，用于肝胆湿热所致的胁痛，症见胁肋及胃腹部疼痛、按之痛剧，大便不通、小便短赤，身热头痛，呕吐不食，胆道疾病见上述证候者[1]。方中大黄具有调节胃肠道、保肝、心脑血管保护、抗肿瘤、免疫调节等作用[2]，金银花具有消炎散热、抑菌、止血、抗病毒、养肝护胆、抗氧化等作用[3]，茵陈具有保肝利胆、利湿退黄、抗炎、镇痛等多种功效[4]，木香具有保肝利胆、解痉、抗炎、抗肿瘤等作用[5]，白芍具有抗炎、镇痛、保肝，对神经系统、骨骼肌等作用[6]，黄芩具有抗菌、抗肿瘤、抑制心脑血管疾病、抗过敏、抗氧化、增强机体免疫、抗炎等作用[7]。但利胆片现行质量标准[1]及文献[8]仅对大黄含量进行测定，文献[9-10]仅对黄芩苷含量进行测定，文献[11-12]仅对绿原酸含量进行测定，文献[13]也仅同时对黄芩苷、绿原酸含量进行测定。因此，本实验参照2020年版《中国药典》[1]及文献[14-22]，建立了HPLC法同时测定利胆片中绿原酸、芍药苷、异绿原酸A、黄芩苷、汉黄芩苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、大黄酚的含量，以期为该制剂质量标准提升提供依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪(配置LC-20AT型输液泵、SIL-20A型自动进样器、CBM-20A型控制器、 CTO-10AS vp型柱温箱、SPD-20A型紫外检测器、DGU-20A5型脱气机、LCsolution色谱工作站)(日本岛津制作所)；MS205型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 试剂与药物 异绿原酸A对照品(批号250034-20107，纯度98.1%)购自上海鸿永生物科技有限公司；绿原酸(批号110753-201716，纯度99.3%)、芍药苷(批号110736-201741，纯度95.7%)、黄芩苷(批号110715-201720，纯度93.5%)、汉黄芩苷(批号112002-201702，纯度98.5%)、木香烃内酯(批号111524-201710，纯度99.5%)，去氢木香内酯(批号111525-201711，纯度99.8%)、大黄酚(批号110796-201621，纯度99.2%)对照品均购自中国食品药品检定研究院。利胆片(太极集团四川绵阳制药有限公司，批号1712006、1806002、1812007)。乙腈为色谱纯(德国默克公司)；其余试剂均为分析纯；水为二次蒸馏水(自制)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取绿原酸、芍药苷、异绿原酸A、黄芩苷、汉黄芩苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、大黄酚对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为879.641 1、445.349 6、205.253 7、530.225 4、141.009 6、301.840 2、380.263 0、102.778 1 μg/mL的贮备液，分别精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2 供试品溶液 取片剂20片，除去包衣，研细，取约0.6 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定质量，水浴回流50 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按处方比例与工艺，分别制得缺茵陈和金银花、缺白芍、缺黄芩、缺木香、缺大黄的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 Thermo Scientific Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～44 min，6%～30%B；44～50 min，30%～54%B；50～70 min，54%～74%B；70～80 min，6%B)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长230 nm；进样量10 μL。

2.3 专属性试验 吸取“2.1”项下对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，阴性样品在对照品、供试品色谱峰保留时间处未发现相应色谱峰，表明阴性无干扰，该方法专属性良好。

1.绿原酸 2.芍药苷 3.异绿原酸A 4.黄芩苷 5.汉黄芩苷 6.木香烃内酯 7.去氢木香内酯 8.大黄酚

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、3.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，在“2.2”项色谱条件下进样10 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.5 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液10 μL，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得绿原酸、芍药苷、异绿原酸A、黄芩苷、汉黄芩苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、大黄酚峰面积RSD分别为0.68%、0.39%、0.67%、0.73%、0.72%、0.84%、0.82%、0.82%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批片剂(批号1712006)6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得绿原酸、芍药苷、异绿原酸A、黄芩苷、汉黄芩苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、大黄酚含量RSD分别为0.92%、0.88%、0.85%、0.91%、1.13%、0.76%、0.81%、0.99%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一份“2.1.2”项下供试品溶液，于0、4、8、16、24 h在“2.2”项色谱条件下进样10 μL测定，测得绿原酸、芍药苷、异绿原酸A、黄芩苷、汉黄芩苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、大黄酚峰面积RSD分别为0.58%、0.90%、0.92%、0.73%、0.60%、0.59%、0.52%、0.63%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 称取各成分含量已知的片剂(批号1712006)6份，每份约0.3 g，精密称定，精密加入“2.1.1”项下对照品溶液1.5 mL、甲醇23.5 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，绿原酸、芍药苷、异绿原酸A、黄芩苷、汉黄芩苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、大黄酚平均加样回收率分别为100.06%、98.46%、98.94%、97.39%、97.81%、99.37%、99.50%、98.62%，RSD分别为0.56%、0.53%、0.50%、0.59%、0.72%、0.52%、0.48%、0.78%。

2.9 样品含量测定 取3批片剂，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长选择 本实验将对照品溶液在190～600 nm波长范围内进行扫描，发现绿原酸在220、330 nm，芍药苷在230 nm，异绿原酸A在219、330 nm，黄芩苷在215、278 nm，汉黄芩苷在275 nm，木香烃内酯在207 nm，去氢木香内酯在216 nm，大黄酚在225、257 nm处有最大吸收，并且在230 nm处各成分响应都较高，能满足定量要求，参考文献[14-22]，最终确定其作为检测波长。

3.2 提取方法选择 本实验参考文献[14-22]，对不同体积分数(60%、70%、80%、90%、100%)甲醇、溶剂用量(10、20、40、60、80倍)、提取时间(30、40、50、60、70 min)、提取方法(回流、超声)进行考察，发现40倍量甲醇回流提取50 min时，各成分均提取完全，回收率可满足试验要求，最终确定其作为提取方法。

3.3 流动相选择 本实验参考2020年版《中国药典》[1]及文献[15-16，20-22]，考察了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸，经反复调整流动相比例及变换梯度，发现乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱时各成分峰形和分离度均良好，最终确定其作为流动相。