汪道兵，高青海，孙玉军

（安徽科技学院 a.农学院；b 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100）

0 引言

老鸦瓣（Tulipa edulis）为百合科郁金香属草本植物，别名迎春草［1-2］。老鸦瓣的鳞茎为中药材光慈菇，具有清热解毒、消肿、抑菌、抗肿瘤等功效［3-4］，多用于治疗痢疾、痛风、咽喉肿痛、蛇虫狂犬伤等［5］。自20世纪90年代以来，国内外学者对光慈菇进行了相关研究，分离得到糖类、生物碱、菲类、黄烷酮类和苷类等50 多种化合物，这些化合物表现出多种药理活性，包括抗肿瘤、抗菌、降压、抗氧化等功能［6］。在民间，夏季将老鸦瓣叶片与面条一起蒸煮以防面条变馊变味。

黄酮类化合物在中药材中分布广泛，是药用植物的有效成分之一。研究发现老鸦瓣叶片黄酮具有较强的抗氧化性［7］和抑菌活性，但关于其性质未见报道。据此，本试验以老鸦瓣叶片为材料，通过提取、分离纯化制备老鸦瓣黄酮，研究其稳定性，为老鸦瓣资源的开发及其黄酮的利用提供参考。

1 材料、仪器与试剂

老鸦瓣（安徽省蒙城县南望槐种植专业合作社馈赠，由安徽科技学院中药学教授刘汉珍鉴定为老鸦瓣。将老鸦瓣叶片烘干，粉碎，过100 目筛，备用。

AR2140 型电子天平（梅特勒-托利多有限公司），U-T6PC 型紫外可见分光光度计（上海屹谱仪器制造有限公司），YRE-5299 型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司），BSZ-100 型自动部分收集器（上海嘉鹏科技有限公司），pH-3C 型酸度计（上海佑科仪器仪表有限公司），PE-1730 型红外光谱仪（美国PEAKIN-ELMER 公司）。

槲皮素标准品（国药集团化学试剂有限公司，批号LOT.NO.F20051117），D-101 型大孔树脂（安徽三星树脂科技有限公司），蔗糖、柠檬酸、维生素C（AR，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 老鸦瓣黄酮的制备

2.1.1 制备流程 取老鸦瓣叶片过筛粉末→加入乙醇→恒温水浴浸提→离心→上清液旋转蒸发→D-110 大孔树脂柱层析→收集洗脱液→旋转蒸发→冷冻干燥→老鸦瓣黄酮。

2.1.2 老鸦瓣黄酮的提取 称取一定量的老鸦瓣过筛粉末，按汪道兵等［7］的方法优化得到的工艺（65%乙醇、料液比1∶20（g·mL-1）、温度 65 ℃、浸提时间 80 min）进行提取，提取液 4 500 r·min-1离心15 min，沉淀再浸提一次，合并上清液，旋转蒸发浓缩，得老鸦瓣黄酮浓缩液。

2.1.3 老鸦瓣黄酮的分离纯化［8］将经无水乙醇预处理的D-101 大孔树脂装柱（2.6 × 50 cm），65 %乙醇平衡3 倍柱床体积后，老鸦瓣黄酮浓缩液上样，65%乙醇洗脱，自动部分收集器收集，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 显色法［9］逐管检测，收集含黄酮部分，合并洗脱液，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥得淡黄色固体干粉。经溶解性能测定，发现老鸦瓣黄酮易溶于不同浓度的乙醇、易溶于水，这与大多数黄酮难溶于水的性质不同。因此，老鸦瓣黄酮具有良好的醇溶性和水溶性的特点，应用范围将会更加广泛。

2.2 老鸦瓣黄酮的鉴定

2.2.1 盐酸镁粉反应［10］取适量的冻干粉于试管中，加入65%乙醇溶解，再加入少许Mg 粉摇振后滴加几滴浓盐酸，摇振后有紫红色泡沫出现，根据特征颜色反应，表明制备的物质含有黄酮类化合物。

2.2.2 紫外可见光谱扫描［11］槲皮素和老鸦瓣黄酮分别采用65%乙醇溶解，按文献［9］的方法加入试剂反应后，于200 ～600 nm 波长范围内扫描，见图1。结果发现，老鸦瓣黄酮（B）和槲皮素（A）的图谱十分相似，均在372 nm 附近有吸收峰，这与文献［12］报道相似，因此将372 nm 作为老鸦瓣黄酮含量的测定波长。但老鸦瓣黄酮的紫外光谱与槲皮素不完全相同，这表明老鸦瓣黄酮除含有槲皮素外还含有其他物质。

2.2.3 红外光谱扫描［11］分别称取3 mg 老鸦瓣黄酮于玛瑙研钵中，再加入100 mg KBr 粉末，研磨混匀，压片，采用PE-1730 红外光谱仪于波数400 ～4 000 cm-1区间扫描，见图2。由图2可知，老鸦瓣黄酮的主要强吸收峰有 3 397、2 925、2 854、1 739、1 604、1 457、1 247、1 209、1 052、588 cm-1等，其中3 397、2 925、1 604、1 052 cm-1与芦丁［13］的官能团相似，波数2 854、1 457、1 209、588 cm-1处的吸收峰与槲皮素［14］的官能团相似，而波数1 739、1 247 cm-1处的吸收峰分别是糖的乙酰酯和C—H 变角振动引起的。因此从老鸦瓣中提取得到的物质为含有槲皮素和芦丁等的黄酮类化合物，其部分基团可能被糖类物质所取代。

图1 槲皮素（A）和老鸦瓣黄酮（B）的紫外可见扫描图谱Fig.1 UV spectra of quercetin (A)and flavonoids from Tulipa edulis(B)

图2 老鸦瓣黄酮的红外光谱Fig.2 FT-IR spectra of flavonoids from Tulipa edulis

2.3 老鸦瓣黄酮含量测定

以槲皮素为标准品，按照文献［9］操作方法绘制标准曲线，得出标准曲线回归方程:Y= 1.072 9X+0.002 1，Y表示吸光度，X表示槲皮素的含量，R2= 0.999 8。按标准曲线操作测得老鸦瓣黄酮的含量为63.09%。

2.4 老鸦瓣黄酮稳定性考察

2.4.1 温度对老鸦瓣黄酮稳定性的影响 于每支试管中加入1 g/L 老鸦瓣黄酮水溶液5 mL，分别置于25、35、45、55、65、75、85、95 ℃的恒温水浴锅中避光恒温1 h，然后取出冷却至室温，按文献［9］的方法加入试剂反应后，于372 nm 波长下测定吸光度（根据紫外可见扫描图谱，确定以A372值来表示黄酮相对含量的多少，下同），考察温度对老鸦瓣黄酮稳定性的影响，见图3。结果发现，在25 ～85 ℃温度范围内，老鸦瓣黄酮的A372值变化不大（P＞ 0.05），当温度大于 85 ℃时，A372突然增大，影响显著（P＜ 0.05），其原因可能是温度过高破坏了老鸦瓣黄酮的分子结构，产生更多的酚羟基导致的。这和王丽娟等［14］研究温度对黑苦荞黄酮稳定性的结果相似。因此，老鸦瓣黄酮应在低于85 ℃的条件下保存或者使用。

图3 温度对老鸦瓣黄酮稳定性的影响Fig.3 Effect of temperature on stability of flavonoids from Tulipa edulis

2.4.2 pH 对老鸦瓣黄酮稳定性的影响 于每支试管中加入1 g/L 老鸦瓣黄酮水溶液5 mL，调pH 值依次为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，静置30 min 后，按文献［9］的方法方法加入试剂反应后，于372 nm 波长下测定吸光度，考察pH 对老鸦瓣黄酮稳定性的影响，见图4。结果发现，老鸦瓣黄酮水溶液A372值在pH 4 ～7 之间时变化不大（P＞0.05），黄酮类化合物因分子中含有多个酚羟基，一般呈弱酸性，在此范围内老鸦瓣黄酮较为稳定。在强酸或偏碱环境中老鸦瓣黄酮的稳定性较差（P＜0.05），因此老鸦瓣黄酮不宜在强酸或偏碱的环境中保存或使用。

图4 pH 对老鸦瓣黄酮稳定性的影响Fig.4 Effect of pH on stability of flavonoids from Tulipa edulis

2.4.3 氧化剂H2O2对老鸦瓣黄酮稳定性的影响 于每支试管中加入1 g/L 老鸦瓣黄酮水溶液5 mL，添加H2O2，使每管中的H2O2浓度依次为0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%（根据食品行业规定，食品中H2O2的允许含量不超过2%［15］），摇匀后在室温下静置1 h，按文献［9］的方法加入试剂反应后，于372 nm波长下测定吸光度，考察氧化剂H2O2对老鸦瓣黄酮稳定性的影响，见图5。结果发现，随着H2O2浓度的不断增大，老鸦瓣黄酮水溶液的A372值随之升高，但升高不显著（P＞0.05），表明氧化剂H2O2对老鸦瓣黄酮水溶液稳定性影响不大，进而说明了老鸦瓣黄酮具有良好的抗氧化活性［16］。

2.4.4 还原剂Na2SO3对老鸦瓣黄酮稳定性的影响 于每支试管中加入1 g/L老鸦瓣黄酮水溶液5 mL，添加Na2SO3，使每管中的Na2SO3浓度依次为0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%（根据食品行业规定，食品中Na2SO3的允许含量不超过0.05%［15］），摇匀后在室温下静置1 h，按文献［9］的方法加入试剂反应后，于372 nm 波长下测定吸光度，考察还原剂Na2SO3对老鸦瓣黄酮稳定性的影响，见图6。结果发现，随着Na2SO3浓度的不断增大，老鸦瓣黄酮水溶液的A372呈下降趋势，表明还原剂Na2SO3对老鸦瓣黄酮的稳定性有较大影响（P＜0.05），使其发生了化学变化。因此，老鸦瓣黄酮在保存或使用时需要避免接触此类物质。

图5 H2O2对老鸦瓣黄酮稳定性的影响Fig.5 Effect of H2O2 on stability of flavonoids from Tulipa edulis

图6 Na2SO3对老鸦瓣黄酮稳定性的影响Fig.6 Effect of Na2SO3 on stability of flavonoids from Tulipa edulis

2.4.5 光照对老鸦瓣黄酮稳定性的影响 于每支试管中加入1 g/L 老鸦瓣黄酮水溶液5 mL，分别在密闭和自然光照射下放置，于0、1、2、3、4、5 d 时定时取样，按文献［9］的方法加入试剂反应后，于372 nm 波长下测定吸光度，研究光照对老鸦瓣黄酮稳定性的影响，见图7。结果发现，随着处理时间的延长，老鸦瓣黄酮水溶液的A372值逐渐下降，且下降趋势为自然光大于避光条件，但均不显著（P＞0.05），表明光照或者避光条件对老鸦瓣黄酮的稳定性影响不大。相比之下，在避光条件下老鸦瓣黄酮的稳定性稍高。

图7 光照对老鸦瓣黄酮稳定性的影响Fig.7 Effect of illumination on stability of flavonoids from Tulipa edulis

3 结论

本试验以老鸦瓣叶片为原料，65%乙醇为提取剂提取老鸦瓣粗黄酮，并采用D-101 大孔树脂柱层析法对老鸦瓣黄酮进行分离纯化。该提取和纯化方法操作方便，成本低廉，适合于老鸦瓣黄酮的制备。

天然类黄酮化合物具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、防腐保鲜等功效，但诸多功效均受到其稳定性的影响。在不同的条件下，黄酮的稳定性具有一定的差异。本试验研究了氧化剂H2O2、还原剂Na2SO3、光照、温度、pH 值等因素对老鸦瓣黄酮稳定性的影响，其中Na2SO3对黄酮的稳定性影响显著（P＜0.05），而温度（＜85 ℃）、氧化剂H2O2、pH 4 ～7 的酸性条件以及在自然光或避光条件对黄酮的稳定性影响不大（P＞0.05）。总之，在试验范围内，老鸦瓣黄酮稳定性较高。另外本课题组研究发现，老鸦瓣黄酮具有体外抗氧化活性［7］，还具有良好的抑菌活性，因此，老鸦瓣黄酮具有一定的应用价值，值得进一步深入研究。