方求武，高 雄，孙曼曼，刘秀霞，李 业，杨艳坤，白仲虎

(1.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 214122;2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122;3.江南大学 生物工程学院，无锡 214122)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是革兰氏阳性细菌，广泛用于氨基酸发酵，如谷氨酸[1]和赖氨酸[2]的生产。近年来，由于其易于分泌目标蛋白[3]，细胞外水解酶活低和无内毒素[4]等特性，已发展成为表达外源蛋白的理想宿主[5]。然而，高强度表达载体的缺乏限制了谷氨酸棒状杆菌的应用。因此，探索和开发一些具有高表达能力的载体具有重要意义，也在一定程度上促进谷氨酸棒杆菌的商业应用。

通过筛选具有高表达能力的启动子和优化核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)序列是目前提高谷氨酸棒杆菌蛋白表达的主要方法。其中，Ptac启动子和乳糖操纵子结合被广泛应用于谷氨酸棒杆菌的各种载体表达[6]。在此基础上，PtacM启动子的修饰会进一步增强蛋白的表达[7]。此外，谷氨酸棒杆菌的几种天然启动子，包括组成型启动子Ptuf、PcspB和Psod和诱导型启动子PprpD2已被应用于工业蛋白的表达[6-9]。另外几种合成启动子PH36、PI16和PL26也被应用于构建蛋白表达载体[10-13]。RBS序列也称SD序列，我们前期研究证实在谷氨酸棒杆菌中Paph启动子与不同RBS序列结合后呈现出不同的蛋白表达能力[14]。作为基因表达的重要部分，RBS序列的优化也已应用于谷氨酸棒杆菌的代谢工程。通过构建RBS文库和调节信号通路基因aroG、aroB、aroD和aroE的RBS强度，建立了几个遗传模块来提高谷氨酸棒杆菌中草酸的产量[15]。……