李幸乐，卢世栋，马红霞，李 懿,叶 莹,黄学勇，郭万申

1)河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 郑州 450016 2)河南省传染病病原生物重点实验室 郑州 450016

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)是由新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)引起的，以发热、干咳、乏力为主要表现的呼吸道传染病。与其他病毒性肺炎相比，COVID-19的早期临床表现不具有特异性，随着疾病的进展，患者可出现继发感染，临床表现更加复杂，对其他疾病的诊疗也有多方面的影响[1-5]。因此，在疾病的各个阶段，实验室诊断和鉴别诊断对于2019-nCoV感染的预防、控制和治疗具有非常重要的指导意义。本研究以一例COVID-19合并Ⅰ型单纯疱疹病毒(human herpesivirus Ⅰ,HSV-1)感染为例，通过实验室技术手段分析COVID-19感染的可能特征，以期为2019-nCoV的防控和临床治疗提供数据支持和技术支持。

1 对象与方法

1.1 调查对象选取河南省2020年1月1日至1月31日期间的COVID-19确诊病例12例作为研究对象。病例纳入标准：①发病前14 d内有武汉旅行史或居住史。②有发热和(或)呼吸道症状。③实时荧光定量PCR检测2019-nCoV核酸阳性。排除免疫缺陷性疾病患者。

1.2 病毒分离取2019-nCoV核酸阳性咽拭子样本进行细胞接种，采用Vero和Vero E6细胞系常规分离病毒，接种后逐日观察细胞病变效应。发生细胞病变者稳定传代；无细胞病变者盲传3代，3代均无细胞病变者按照阴性处理。

1.3 2019-nCoV核酸检测采用实时荧光定量PCR法对分离株病毒二代培养物进行2019-nCoV核酸检测。病毒分离株首先于56 ℃30 min灭活，然后采用西安天隆生物科技有限公司生产的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取总RNA，用上海伯杰医疗科技有限公司生产的2019-nCoV核酸检测试剂盒进行鉴定，仪器为美国ABI公司生产的7500Fast实时荧光定量PCR仪，按照试剂盒和仪器使用说明操作。

1.4 基因组序列测定分析采用北京微未来科技有限公司生产的2019-nCoV全基因组捕获试剂盒对毒株进行全基因组DNA建库，非2019-nCoV毒株采用杭州杰毅生物技术有限公司生产的全自动核酸检测反应体系构建系统进行宏基因组DNA建库，采用美国Illumina公司的MiSeq测序平台进行序列测定，采用北京微未来科技有限公司的nCoV和MicroSpectrum病原体鉴定分析软件分析测序结果。均按照试剂盒和仪器使用说明操作。

1.5 生物安全控制COVID-19病例样本的采集和实验活动严格遵守相关的生物安全规定：采样人员在采样过程中采取个人生物安全三级防护；病毒分离培养和病毒灭活在BSL-3级实验室进行。

2 结果

2.1 病例基本情况和病毒分离结果12例12份咽拭子样本中分离得到5株病毒。5株病毒在Vero和Vero E6细胞上均产生典型病变且病变可以稳定传代；病变均表现为细胞圆缩、聚集和脱落。5株病毒命名为HN01～HN05。HN03株培养物在传代过程中观察到支原体感染现象。

HN03株来源病例卫某，男，27岁，河南洛阳人，发病前为武汉市某农贸市场冷库管理员； 2020年1月13日出现发热、干咳症状；19日出现高热(40 ℃)、呼吸困难、胸闷、乏力和气促症状并入住河南科技大学第一附属医院；21日采集咽拭子样本(原始样本)进行2019-nCoV核酸检测，呈阳性。临床分型为普通型。

2.2 2019-nCoV核酸检测HN03株表现为弱阳性。分别对HN03株一代、二代和三代培养物进行2019-nCoV核酸检测，无论是Vero还是Vero E6细胞，Ct值均随培养代次的增加而升高，第三代培养物表现为阴性。余4株各代培养物均为阳性。

2.3 基因组序列测定分析经MiSeq测序，HN01株、HN02株、HN04株和HN05株获得2019-nCoV全基因组序列。GenBank序列号依次为MT412338、MT412134、MT412339和MT412340；HN03株获得部分2019-nCoV基因序列。对HN03株三代培养物的分析结果显示无2019-nCoV基因序列。MicroSpectrum病原体鉴定分析软件比对了116种病原体，HN03株三代培养物中可检出10种病原体，其中HSV-1占绝对优势，此外猪鼻支原体占据相当的比例，详见图1。

图1 COVID-19病例分离毒株HN03株宏基因测序比对分析图

3 讨论

人类HSV感染极为普遍，且初次感染后多转为潜伏感染。HSV-1是临床常见的免疫抑制性感染性病原。当机体受其他细菌、病毒感染或者细胞免疫受抑制时，HSV-1可被激活。HSV-1感染通常表现为口唇、皮肤和角膜等机体浅表层疱疹或炎症，此外HSV-1感染还可引起脑炎、脊髓炎和神经根炎。2019-nCoV可侵犯全身多组织、器官，感染者以肺和免疫系统损害为主。因此，2019-nCoV和HSV-1合并感染是可能存在的，HSV-1感染更可能是继发于2019-nCoV感染。

人类对2019-nCoV普遍易感，且感染者以轻型为主，如果缺乏明确的流行病学史，从临床表现方面难以区分COVID-19与其他病毒性肺炎，必须借助实验室技术手段[6]。另外，COVID-19重症和危重症患者通常合并有细菌和真菌感染[7]，掌握COVID-19重症、危重症患者继发感染的特征，对临床治疗具有积极意义。如何系统、科学地运用实验室技术手段实现早期快速诊断的目的，需要根据情况合理安排。本例首先以实时荧光定量PCR进行早期快速诊断，随后采用细胞培养技术分离病毒株，采用基因组序列测定分析技术对病毒株进行鉴定，证实HN03株源病例为2019-nCoV合并HSV-1感染病例。荧光定量PCR方法迅速、灵敏，细胞培养技术可获得具有生物活性的病毒株，宏基因组序列测定分析技术可同时锁定多种病原。

支原体是可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物。支原体广泛存在于人体和动物体内。猪鼻支原体既是猪鼻腔的正常寄居微生物，也是细胞培养中常见的污染微生物。本研究在细胞培养阶段在HN03株培养物内观察到支原体感染现象，其他样本没有这种现象，提示猪鼻支原体并非来自培养过程中的污染，应该来自源病例样本。有研究[8]显示猪鼻支原体与多种人类恶性肿瘤有显著相关性，暂未发现猪鼻支原体导致肺炎的病例。流行病学调查显示猪鼻支原体感染可能发生在病例于农贸市场从事冷库管理工作期间，与2019-nCoV感染无关。