王博昊，易志杰，黄雨馨，袁 春，李 懿，贺志权，田 诚，陈艳萍，王海峰，马红霞，郭万申，黄学勇1，

1)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001 2)加利福尼亚大学欧文分校公共卫生学院 美国加利福尼亚州尔湾 92697 3)中国人民解放军联勤保障部队第九九〇医院感染科 河南信阳 464000 4)河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 郑州 450016

发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是由于感染新布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus，SFTSV)而引起的感染性疾病[1]，其主要临床表现为发热、血小板(PLT)减少，并可伴恶心、呕吐、乏力、纳差、腹泻、肌肉酸痛等，病情危重者可出现皮肤淤斑、肺出血、消化道出血及意识障碍等，乃至发生多脏器功能衰竭[2]。目前在我国河南、山东、辽宁、江苏等省份均有病例报告，病死率为12%～30%[3]。针对该病尚无特效药，故常用利巴韦林等抗病毒药物进行对症治疗[4]；早期诊断及对症治疗对改善SFTS预后有重要意义。本研究旨在分析SFTS患者病情和SFTSV载量与实验室检测指标之间的关系，进而探索影响病毒载量的因素，为患者疾病严重程度分级和预测患者预后提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2019年5月、6月中国人民解放军联勤保障部队第九九〇医院感染科确诊的69例SFTS患者为研究对象，参照《发热伴血小板减少综合征防治指南(2010版)》[5]，根据流行病学史、临床表现及实验室检测结果进行SFTS的诊断。病例入选标准：①有发热、恶心、疲劳乏力及肌肉酸痛等症状。②外周PLT和白细胞(WBC)降低。③血清SFTSV核酸阳性。收集确诊的SFTS患者的临床诊断资料和流行病学资料，于急性期(发病1～5 d)采集静脉血5 mL，分离血清置-40 ℃保存。

1.2 病情严重程度分组参照袁义美等[6]、Deng等[7]的研究，将研究对象分为轻型、重型及危重型3组。轻型：体温38 ℃以下，全身不适及肌肉酸痛，有明显纳差、腹泻、恶心、呕吐等消化道症状，无神经系统症状及出血症状。重型：体温38.0 ℃及以上，极度乏力，精神萎靡，食欲不振；出现神经系统症状(如下颌、四肢不自主抖动，肌张力增加，神志恍惚，昏睡，躁妄等)；老年患者多伴有基础性疾病，可合并肺部感染。危重型(在重型基础上符合下列标准之一的)：①急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征。②心力衰竭。③急性肾功能衰竭。④脑炎。⑤休克。⑥败血症。⑦弥散性血管内凝血。⑧死亡。

1.3 主要试剂及仪器RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；SFTSV RNA检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)由河南省疾病预防控制中心和北京华大吉比爱生物技术有限公司联合研制，由北京华大吉比爱生物技术有限公司生产；One-Step RT-ddPCR反应试剂盒、微滴发生油、ddPCR微滴分析油等均购自美国Bio-Rad公司。qRT-PCR仪(美国ABI公司)，微滴数字PCR仪(美国Bio-Rad公司)，-80 ℃低温冰箱(美国Thermo公司)。

1.4 SFTSV RNA的One-Step ddPCR检测将RNA模板及试剂盒中所需组分融化并置于冰上备用，根据检测样本数准备反应液。按照每样本Supermix 5.0 μL，反转录酶2.0 μL，DTT 1.0 μL，靶引物1.6 μL，探针0.5 μL，RNase-free water 4.3 μL，总RNA 4.0 μL配制反应体系。准备1.5 mL离心管，将反应体系混合振荡30 s，瞬时离心5 s，按9.0 μL/管分装至八联反应管中。取11.0 μL待测样本、阳性对照、阴性对照，分别加入到已分装的反应体系中，混匀，瞬时离心，排除底部气泡。将混合好的PCR反应液加入微滴发生卡中，加入70.0 μL微滴发生油，按照仪器说明进行微滴生成。将生成的微滴转移至96孔板内，封膜，PCR扩增；反应条件为48 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，40个循环；98 ℃ 10 min。使用微滴数字PCR仪读取结果，使用FAM通道读取信号。当阳性微滴>2 copies/反应，且微滴总数不少于10 000个，判断为阳性；当无阳性微滴检出，且微滴总数大于10 000个，结果为阴性；若阳性对照无阳性微滴检出或阴性对照有阳性微滴检出，且微滴总数大于10 000个，则进行复检。

1.5 统计学处理采用R 4.0.1和SPSS 21.0分析数据。应用χ2检验、Fisher 确切概率法、单因素方差分析和LSD-t检验、秩和检验[不满足正态分布的资料，用中位数(四分位数)表示]比较3组患者基本情况及临床特点、实验室检测指标的差异，应用Spearman秩相关进行疾病严重程度相关因素、病毒载量相关因素的相关性分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组患者基本情况及临床特点比较69例患者均为信阳市及周边地区的中老年农民，其中男34例(49.28%)，女35例(50.72%)；年龄16～85(61.2±10.9)岁。既往有高血压8例，糖尿病5例，慢性阻塞性肺病1例，脑梗死1例；合并肺气肿、支气管炎16例。3组患者基本情况及临床特点详见表1。由表1可知，3组患者基本情况及临床特点比较差异均无统计学意义。

表1 3组患者基本情况及临床特点比较

2.2 3组患者实验室检测指标比较详见表2。

表2 3组患者实验室检测结果比较

2.2.1PLT和WBC 有58例(84.1%)患者PLT异常，61例(88.4%)患者WBC异常。

2.2.2肝、肾功能指标 有55例(79.7%)患者天门冬氨酸氨基转移酶(AST)异常，32例(46.4%)患者谷丙转氨酶(ALT)异常，17例(24.6%)患者谷氨酰转肽酶(GGT)异常，21例(30.4%)患者肌酐(Cr)异常。

2.2.3心肌酶指标 有65例(97.0%)患者肌酸激酶(CK)异常，有57例患者血清乳酸脱氢酶(LDH)异常。

2.2.4SFTSV载量 3组患者间的SFTSV载量差异有统计学意义，轻症组<重症组<危重症组(H=21.614，P<0.001)。

2.3 各变量间相关分析结果

2.3.1疾病严重程度相关因素 年龄(rs=0.478，P<0.001)、SFTSV载量(rs=0.532，P<0.001)、AST(rs=0.439，P<0.001)、ALT(rs=0.307，P=0.007)、LDH(rs=0.476，P<0.001)和CK(rs=0.408，P<0.001)与患者疾病严重程度呈正相关；PLT(rs=-0.387，P=0.023)和WBC(rs=-0.372，P<0.001)与疾病严重程度呈负相关；GGT(rs=0.161，P=0.066)和Cr(rs=0.068，P=0.840)与疾病严重程度无关。

2.3.2病毒载量相关因素 PLT(rs=-0.347，P=0.012)和WBC(rs=-0.307，P=0.014)与SFTSV载量呈负相关。LDH(rs=0.353，P=0.008)与SFTSV载量呈正相关，关联性较强；其次为AST(rs=0.348，P<0.001)、淋巴结肿大面积(rs=0.346，P<0.001)、ALT(rs=0.331，P=0.007)和CK(rs=0.329，P=0.008)；年龄与SFTSV载量的关联性较弱，相关系数为0.273(P=0.020)。

3 讨论

目前针对SFTS尚无特效药物，现有治疗手段均为支持性对症治疗[4]。SFTS患者临床表现主要为发热、疲劳乏力并伴有全身酸痛[8]，部分患者还会出现恶心，疾病初期表现与其他许多病毒感染性疾病表现相似。与其他出血热类似，SFTS还可引起胃肠道症状，WBC和PLT减少，组织酶升高，血尿、蛋白尿[9]，这些现象都导致在疾病初期难以鉴别SFTS，给患者的诊断和治疗造成困难。在高发流行地区，估计有8.3%的SFTS病例未被诊断[10]。SFTS患者中多为中老年农民，重症患者会出现神经症状和出血症状，甚至会因多脏器衰竭而导致死亡[2]。及时的干预及对症治疗对患者预后有重要影响，因此，患者在疾病早期的诊断鉴别就显得尤为重要。由于确诊需要检测患者SFTSV RNA，找到疾病严重程度与SFTSV、疾病严重程度与各项实验室检测指标之间的相关关系具有重大意义，可为患者严重程度分级、患者病情发展预测提供重要依据。

发热、PLT减少、WBC减少是SFTS的特征现象[11]，并且临床医生也多将此作为患者初期诊断的临床诊断依据。本研究结果显示，确诊患者中，轻症、重症和危重症3组间PLT、WBC异常者分布差异无统计学意义，提示临床上根据PLT减少、WBC减少现象仅能将SFTS患者从人群中识别出来，却难以据此将患者的疾病严重情况进行进一步的分级。本研究结果还显示，除GGT、Cr外，其余实验室检测指标(WBC、PLT、AST、ALT、CK、LDH和SFTSV载量)在轻症、重症和危重症患者间差异均有统计学意义，说明这些变量与患者的疾病严重程度之间存在关联，以此作为患者病情严重程度分级的依据具有重要的意义。

通过关联性分析可知，SFTSV载量与疾病严重程度关联性较强。周麟玲等[12]的研究发现，SFTS患者脏器衰竭或发生DIC时血清SFTSV载量持续较高。同时，中枢神经系统症状、出血倾向、高病毒载量(>1×105copies/mL)是SFTS患者死亡的危险因素。这些都说明病毒载量与患者病情密切相关。AST、ALT、CK和LDH不仅与患者疾病严重程度存在关联，而且与SFTSV载量之间也存在着相关关系。心肌酶谱是心肌损伤的重要实验室检测指标，提示心肌、肝脏的损伤情况。而SFTSV感染机体后，不仅会造肝脏及肾脏的损伤，而且会激活机体的免疫系统，致使机体释放大量IL-6等促炎因子，进一步加重组织器官的损伤[13]。因此AST、ALT、CK和LDH是随着SFTSV载量的升高而变化，还是由于高病毒载量引起脏器损伤而导致的AST、ALT、CK、LDH等指标升高，需要进一步探究。

综上，WBC、PLT、AST、ALT、CK和LDH等实验室检测结果与患者疾病严重程度及患者血清SFTSV载量之间均存在着一定联系，可以作为将患者病情分级的重要依据。同时，SFTSV载量作为监控患者病情发展及预测患者预后的指标具有十分重大的意义，有必要进行深度挖掘研究。