刘丽莎，张琳琳，袁恩武，石 瑛，杜红梅，高峻峻，李 伟，张 展

郑州大学第三附属医院检验科 郑州 450052

人类成功的妊娠过程依赖于绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblasts, EVT)对子宫结缔组织和子宫螺旋动脉的侵袭作用，EVT侵袭能力降低可致母体血液无法充足地供应到绒毛间腔，妊娠期的多种不良结局由此引起[1-2]。已知基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可参与细胞侵袭过程[3-4]。Ⅳ型胶原是滋养细胞外基质的主要组成部分，又是MMP-2、MMP-9发挥水解作用的底物，因此MMP-2和MMP-9被认为是参与滋养细胞外基质降解从而实现细胞侵袭的重要蛋白酶[5-7]。多项研究[8-9]结果显示，信号转导及转录活化因子3蛋白(STAT3)在乳腺癌和胃癌细胞中参与调控下游靶因子MMP-2和MMP-9的表达。此外，Deshmukh等[10]的研究表明，IL-6可以上调乳腺癌细胞内磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达，从而激活STAT3信号传导通路，促进肿瘤细胞增殖和侵袭。人绒毛膜癌滋养细胞系JEG-3细胞的分子结构与EVT相似，多数学者采用该细胞系作为研究EVT侵袭功能的模型[11]。本研究中，我们首先观察了STAT3活性抑制剂对JEG-3细胞STAT3及MMPs表达的影响，以验证STAT3的作用通路，然后观察了IL-6干预后，JEG-3细胞侵袭能力、STAT3及MMP-2、MMP-9表达的变化，旨在探讨JEG-3细胞侵袭能力改变的机制，进一步探索由EVT侵袭能力失调导致不良妊娠的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞来源与主要试剂JEG-3细胞购自中国北京鼎国昌盛公司。DMEM-H培养基购自Genview公司，小牛血清由Sigma公司提供，STAT3活性抑制剂(SD-1008)为R&D公司产品，IL-6购自Peprotech公司，侵袭小室购自康宁公司，荧光定量PCR试剂购自北京康为世纪公司，STAT3、MMP-9鼠抗人一抗[可同时检测MMP-9酶原前体蛋白(Pro-MMP-9)和MMP-9活化蛋白(Active-MMP-9)]及p-STAT3兔抗人一抗购自美国CTS公司，MMP-2兔抗人一抗[可同时检测MMP-2酶原前体蛋白(Pro-MMP-2)及MMP-2活化蛋白(Active-MMP-2)]购自美国Abcam公司,β-actin鼠抗人一抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养与实验分组JEG-3细胞用含体积分数10%小牛血清的DMEM-H培养基，在37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养。取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞密度为0.6×106个/mL，接种于6孔板中，每孔加2.5 mL细胞悬液，继续孵育24 h。实验1分为空白对照组和抑制剂组(5 μmol/L SD-1008)；实验2分为空白对照组和IL-6组(10 μg/L IL-6)。

1.3 STAT3活性抑制剂对JEG-3细胞中STAT3、p-STAT3及MMP-2、MMP-9表达的影响收集按实验1分组处理24 h的细胞[12]，加入蛋白提取液提取总蛋白。吸取80 μg蛋白置于微量EP管内进行加热预变性，之后加入凝胶孔，进行电泳、切胶、转膜、封闭、洗膜。之后在冷库分别与一抗(β-actin、STAT3、MMP-2、MMP-9抗体按1∶1 000稀释,p-STAT3抗体按1∶2 000稀释)孵育12 h。然后洗膜3遍，与HRP标记的二抗孵育1 h，再次洗膜后经ECL发光液显像、胶片曝光定影。采集图像，经Gel Logic 2000系统读取条带灰度值。以目的蛋白条带与内参条带灰度值之比为目的蛋白的相对表达量。实验重复6次。

采用荧光定量PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA的表达。用离心管收集按实验1分组处理24 h的细胞，用Trizol试剂提取总RNA，反转录得cDNA。然后按试剂说明书进行PCR，反应体系为20 μL，扩增条件：95 ℃10 min；95 ℃15 s；60 ℃1 min；共35个循环。选择36B4为内参，引物序列见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。使用2-ΔΔCt法计算MMP-2、MMP-9 mRNA的表达水平。实验重复6次。

表1 荧光定量PCR的引物及产物长度

1.4 IL-6对JEG-3细胞增殖能力、侵袭能力以及STAT3、MMP-2、MMP-9表达的影响

1.4.1IL-6对JEG-3细胞增殖能力的影响 收集按实验2分组处理36 h后的细胞，加入MTT试剂，继续孵育4 h。弃去培养孔中的液体，加入0.2 mL DMSO，在摇床中摇动10 min。用酶标仪读取每孔在490 nm波长处的光密度(OD)值，用以评估细胞增殖能力。实验重复6次。

1.4.2IL-6对JEG-3细胞侵袭能力的影响 采用无血清培养基调整JEG-3细胞密度为2.5×105个/mL，按实验2分组处理后，将200 μL细胞悬液加至Transwell小室上室，加入750 μL完全培养基，放回温箱中继续孵育36 h。采用PBS溶液洗膜，再经固定、透化和染色，最后置于显微镜下计数穿膜细胞。每个小室计数8个视野(×200)，取均值。实验重复6次。

1.4.3IL-6对JEG-3细胞中STAT3活化的影响 用无血清培养基孵育JEG-3细胞6 h后，按实验2分组干预，干预后10、30、60 min提取蛋白，检测JEG-3细胞中p-STAT3蛋白的表达[13]，检测方法同1.3中Western blot实验。实验重复6次。

1.4.4IL-6对JEG-3细胞中MMP-2、MMP-9表达的影响 JEG-3细胞按实验2分组处理36 h后，同1.3中方法分别检测细胞中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA的表达。实验重复6次。

1.5 统计学处理使用SPSS 17.0 分析数据。采用两独立样本t检验分析空白对照组和抑制剂组细胞中STAT3、p-STAT3、MMP-2、MMP-9表达的差异以及空白对照组和IL-6组细胞增殖能力、侵袭能力及p-STAT3、MMP-2、MMP-9表达的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 STAT3活性抑制剂对JEG-3细胞STAT3、MMPs表达的影响STAT3活性抑制剂SD-1008干预24 h，JEG-3细胞中p-STAT3蛋白表达量降低，MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达量亦降低(Active-MMP-9条带灰度值过低，未进行数据分析)。见图1、表2。

1、2：空白对照组；3、4：抑制剂组

表2 STAT3活性抑制剂对JEG-3细胞STAT3、MMPs表达的影响

2.2 IL-6对JEG-3细胞增殖能力和侵袭能力的影响与空白对照组相比，IL-6组JEG-3细胞增殖能力无明显变化，但侵袭能力增强。见表3。

表3 IL-6对JEG-3细胞增殖能力和侵袭能力的影响

2.3 IL-6对JEG-3细胞p-STAT3表达的影响与空白对照组相比，IL-6组JEG-3细胞中p-STAT3的表达量在3个时间点均无明显改变(因p-STAT3蛋白灰度值均过低而未行数据分析)(图2)。

1：空白对照组，2、3、4：分别为IL-6干预10、30、60 min

2.4 IL-6对JEG-3细胞MMPs mRNA、蛋白表达的影响与空白对照组相比，IL-6组细胞中Active-MMP-2蛋白表达量增加，但MMP-2、MMP-9 mRNA及Pro-MMP-2、Pro-MMP-9蛋白的表达量无明显改变(Active-MMP-9条带灰度值过低，未进行数据分析)(图3、表4)。

1、2：空白对照组；3、4：IL-6组

表4 IL-6对JEG-3细胞MMPs蛋白、mRNA表达的影响

3 讨论

研究[14-15]显示，STAT3与非小细胞肺癌、人结肠癌的侵袭有关。STAT3信号通路是调节细胞侵袭功能的重要途径之一，通过激活胃癌细胞中STAT3的磷酸化可以增加细胞的侵袭能力并上调细胞中MMPs的表达；而抑制乳腺癌细胞中STAT3介导的信号通路，可下调MMPs的表达并降低细胞的侵袭性[8，16]。有证据[17]表明，抑制鼠类STAT3基因的转录及磷酸化，其妊娠过程受到了严重阻碍。SD-1008是一种能直接阻断JAK/STAT3信号通路的抑制剂[18]。本研究中，采用SD-1008对JEG-3细胞进行干预后，细胞中p-STAT3、MMP-2、MMP-9蛋白及MMP-2、MMP-9 mRNA的表达下降，由此推测STAT3可能是EVT中MMP-2和MMP-9的上游调控因子之一。

白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)和IL-11已被证实分别通过STAT3信号转导通路进行细胞内信号的级联传递，从而调节EVT和肿瘤细胞的侵袭能力[19-20]。IL-6与这些因子都属于“IL-6细胞因子超家族”的成员，都以细胞膜的gp130结合蛋白作为受体进行细胞内外信号的传递。本研究探讨了外源性IL-6对JEG-3细胞的影响，发现10 μg/L IL-6刺激36 h后，JEG-3细胞侵袭能力明显升高。但是，Fitzgerald等[21]的研究数据表明IL-6对JEG-3细胞的侵袭能力没有明显影响，可能的原因是IL-6浓度以及作用时间不同。本研究中MTT实验结果显示，10 μg/L IL-6对JEG-3细胞的增殖能力无明显影响，排除了细胞增殖能力的改变对侵袭实验的影响，进一步证实了IL-6可以提高JEG-3细胞的侵袭性。另外有研究[22-23]发现，IL-6对其他EVT(如HTR-8/Svneo细胞系和AC-1M88细胞系)有着相似的侵袭和趋化能力增强作用。因此我们认为，一定浓度的IL-6对维持和增加EVT的侵袭性有着重要的作用。

与预期实验结果不同的是，JEG-3细胞经IL-6干预后的侵袭能力增加，但是p-STAT3、Pro-MMPs的表达水平无显著变化，这说明虽然STAT3信号转导通路对JEG-3细胞中MMPs的表达有重要调节作用，但是IL-6并未通过该信号转导通路调节JEG-3细胞的侵袭能力。同时我们发现，IL-6干预后的JEG-3细胞中活化形式的MMP-2(Active-MMP-2)表达水平升高，这点让我们感到意外，因为MMPs在合成时多以酶原的形式存在，一般通过从前体形式释放抑制性前肽域而被激活才能获得降解细胞外基质和基底膜的能力[4，24]。另外，Feng等[25]发现IL-6可以通过Raf-MAPK-ERK1/2通路上调细胞内MMP14的表达；而文献[26]表明MMP-2的活化与细胞表面MT1-MMP(MMP14)的调控密切相关。结合本研究结果，我们推测IL-6刺激滋养细胞MMP-2活化的机制可能与上调MT1-MMP有关，有待后续进一步深入研究。

综上所述，STAT3可能是诱导JEG-3细胞表达MMP-2和MMP-9的关键上游调控因子之一；但是IL-6并未通过该通路调节其侵袭能力，而是可能通过其他信号转导通路增强细胞中MMP-2的活化而上调滋养细胞的侵袭能力。