程志芬 ，杨 磊，郭留云

1)郑州大学第一附属医院口腔科 郑州 450052 2)济源市人民医院口腔科 河南济源 454650

慢性牙周炎是常见的口腔疾病之一，严重者可导致牙齿松动脱落，影响咀嚼，降低人们的生活质量[1]。我们前期研究[2]发现，Hedgehog(Hh)信号通路的配体Shh、IL-6在牙周炎龈沟液中均高表达，提示Hh信号通路可能参与调节牙周炎症反应。TNF-α作为炎症因子[3]，其与Hh信号通路是否有关尚未明确。本研究对牙周炎患者的牙龈组织中Shh、TNF-α和IL-6的表达水平进行了检测，分析其与菌斑指数(plaque index,PLI)、牙龈出血指数(gingival bleeding index,BI)、牙周袋深度(periodontal probing depth,PD)、临床附着丧失(clinical attachment loss,CAL)之间的相关性，探讨其可能在慢性牙周炎发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器兔抗人Shh、TNF-α、IL-6抗体(美国Abcam公司)；HRP标记的山羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限责任公司)；免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 病例选择选取从2018年5月至2019年7月于郑州大学第一附属医院口腔科就诊的符合纳入标准的慢性牙周炎患者共60例(男33，女27)，按牙周炎严重程度[2]分为轻、中、重3组，每组各20例。另选取行牙冠延长术的牙周健康者20例为健康对照(男10女10)。纳入标准：①近3个月内无抗生素及类固醇类药物服用史，无牙周基础治疗史。②无全身系统性疾病如高血压、糖尿病等。③无个人吸烟史。④无家族遗传史。⑤女性患者未处于月经、妊娠、哺乳期。⑥知情同意。

1.3 临床指标的测定根据Quigley-Hein法检查并记录全口牙位的PLI，以0～5级计分；根据Mazza记分法检查并记录BI，以0～5级计分；采用Williams刻度的牙周探针探查PD到釉质牙骨质连接处的距离，计算CAL值[4]。

1.4 牙龈样本的收集健康对照组和轻度慢性牙周炎组：行牙冠延长术切除的牙龈；中度慢性牙周炎组和重度慢性牙周炎组：行牙周翻瓣术切除的牙龈，或部分松动牙拔除后进行牙龈修整时切除的牙龈。切除的牙龈组织置40 g/L多聚甲醛中固定。

1.5 牙龈组织中Shh、TNF-α和IL-6蛋白的免疫组化检测采用免疫组化SP法。牙龈组织常规石蜡包埋，4 μm厚切片，脱蜡水化，EDTA缓冲液修复，按照试剂盒说明书进行Shh、TNF-α和IL-6蛋白的免疫组化SP染色。以细胞核和(或)细胞质出现棕褐色或黄褐色颗粒为阳性表达，光学显微镜观察。采用医学图像分析系统，随机选取5个视野(×400)，测定光密度(OD)，求出平均值，代表目的蛋白的表达水平。

1.6 统计学处理采用SPSS 22.0进行分析，各组基本资料、牙周临床指标的比较采用χ2检验或单因素方差分析(组间两两比较采用LSD-t检验)。蛋白表达与牙周临床指标的相关关系采用Pearson相关性分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 受试对象基本资料各组性别和年龄见表1。

表1 4组受试者性别和年龄比较

2.2 各组牙周临床指标的比较结果见表2。

表2 4组PD、CAL、PLI、BI测定结果

2.3 各组牙龈组织中Shh、TNF-α和IL-6蛋白的表达各组牙龈组织上皮层及固有层Shh、TNF-α和IL-6蛋白均有阳性表达。健康对照组中以上蛋白表达量少且较弱。轻、中、重度慢性牙周炎组，Shh、TNF-α和IL-6蛋白表达水平逐渐增加(图1、表3)。

A：健康对照组;B：轻度慢性牙周炎组;C：中度慢性牙周炎组;D：重度慢性牙周炎组

表3 各组牙龈组织中Shh、TNF-α、IL-6蛋白的表达

2.4 牙龈组织中Shh、TNF-α、IL-6表达水平与牙周临床指标的相关性牙龈组织中Shh、TNF-α和IL-6的表达与牙周临床指标PD、CAL、BI呈正相关(表4)。

表4 牙龈组织中Shh、TNF-α和IL-6表达水平与PD、CAL、PLI、BI的相关性 r(P)

3 讨论

牙周炎是牙列缺损、缺失的主要病因之一。牙菌斑是始动因子，菌斑内的细菌及其产物持续刺激牙龈，牙龈组织发生免疫炎症反应，无外界干预下可持续发展，导致牙龈组织破坏、牙槽骨吸收，最终导致牙齿脱落[5]。牙周炎除了引起牙齿周围支持组织的破坏外，对心血管疾病、糖尿病等系统性疾病也存在潜在的影响[6]。因此，明确牙周炎发生发展机制，对牙周炎的诊疗和预防具有重要意义。

TNF-α可与牙龈上皮细胞表达的受体结合，诱导牙龈上皮细胞表达破骨细胞分化因子[7]；同时作为促炎因子，促进牙龈上皮细胞和成纤维细胞凋亡，可加重炎症对组织的破坏程度[8-9]。有研究[10-12]发现在健康志愿者和牙周炎患者的龈沟液中均有TNF-α表达，但健康对照的表达较低，且龈沟液中TNF-α的表达与牙周临床指标龈指数、BI、PD、CAL显著相关。IL-6是一种四螺旋结构的细胞因子，与TNF-α一样，在牙周炎的免疫应答过程中发挥重要作用。IL-6与其受体结合后再与牙龈成纤维细胞结合，刺激牙龈成纤维细胞表达基质金属蛋白酶1，引起细胞外基质的破坏。同时，IL-6可通过刺激成骨细胞释放破骨细胞分化因子RANKL，激活破骨细胞，造成骨组织破坏[13]。有研究[14]发现，牙周炎牙龈组织内IL-6表达高于健康对照，同时IL-6在慢性牙周炎龈沟液中也高表达，且与牙周临床指标PD、CAL、PI相关[15]。本研究结果显示，TNF-α和IL-6在健康对照组中有微量表达，在慢性牙周炎组随着炎症程度增加表达增多。TNF-α和IL-6的表达与PD、CAL和BI均呈正相关，与PLI无相关性。以上结果提示TNF-α和IL-6参与慢性牙周炎的发展进程且具有重要的促进作用，随着其表达量的增加，出血、附着丧失等牙周炎临床症状加重。

Shh是Hh信号通路的配体之一，Hh信号通路参与胚胎发育、干细胞维持、组织修复再生以及肿瘤发生发展等过程[16-18]。Shh与细胞膜上的受体Ptch结合，激活Hh信号通路，调控靶基因的表达。有研究[19]显示，Shh在小鼠急性胰腺炎组织中高表达，抑制Shh后胰腺组织的破坏加重，Shh可通过调节IL-10表达实现对急性胰腺炎的保护作用。Shh在慢性胆囊炎胆囊组织中的表达同样增高，且随着炎症程度的增加表达增高[20]。研究[21]发现，抑制Shh信号通路，TNF-α和IL-6在佐剂性关节炎大鼠软骨中的表达降低，减弱了骨组织的破坏和炎症细胞的浸润。本研究结果显示，Shh在健康对照组中表达较低，在慢性牙周炎中高表达，且随着炎症程度的增加，Shh的表达也增高。同时Shh与牙周临床指标PD、CAL、BI呈正相关。

总之，TNF-α和IL-6作为促炎因子在慢性牙周炎发展过程中的作用不容忽视，Shh参与的Hh信号通路可能参与牙周炎的发生发展过程，在慢性牙周炎炎症因子的调控网络中发挥作用；Shh可能成为判断慢性牙周炎发生发展的新指标。