李 劲，王俊翔，罗周嵩，郑馥荔，吴思英，李煌元

环境因素如重金属等的暴露能够引起氧化应激，导致神经系统损害，加剧神经退行性疾病的发生发展[1-2]。研究发现，钴纳米颗粒(cobalt nanoparticles, Co-NPs)可能通过多种途径暴露，诱导细胞发生氧化应激，促进细胞凋亡，对人体产生神经损害[3-8]。本研究拟采用大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12作为体外模型，通过检测Co-NPs染毒后的神经损害作用、氧化应激指标变化、核因子类红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2, NRF2)/血红素加氧酶(heme oxygenase-1, HO-1)抗氧化信号通路的激活及NRF2特异性激活剂(tert-butylhydroquinone,tBHQ)预处理，探讨Co-NPs对神经细胞的毒效应及氧化应激作用，为评估Co-NPs的神经毒性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 Co-NPs(中国阿拉丁生化科技股份有限公司)，处理与表征方法及结果见文献[9]。Co-NPs平均粒径为96 nm。zeta电位14.9 mV，多分散指数为0.471。Co-NPs在水溶液中钴离子12 h 的释放率为1.52‰，24 h为1.75‰。DMEM高糖细胞培养基、胎牛血清及抗生素(美国Gibco公司)；Hoechst33258染料(中国碧云天生物技术有限公司)；CCK8试剂盒(中国白鲨生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)试剂盒(中国南京建成生物工程研究所)；Annexin V/7-AAD(美国BD公司)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、NRF2、HO-1抗体(美国Abcam公司)；tBHQ(美国MCE公司)。

1.1.2 仪器 倒置显微镜(CK40-F200 BH-2型，日本OLYMPUS公司)；生物成像系统(Tanon 4100型，上海天能公司)；垂直电泳槽、电泳仪、转印槽(美国Bio-Rad公司)；酶标仪(Spectra Max 190型，美国Molecular Devices公司)；流式细胞仪[FACSCanto(TM)Ⅱ型，美国BD公司]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 PC12细胞来自大鼠的嗜铬细胞瘤(中国科学院上海细胞库)，置于含10%胎牛血清、双抗(青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L)的DMEM高糖细胞培养基中培养(37 ℃，体积分数为0.05的 CO2培养箱)，生长至对数生长期时种板。……