刘张嫔，李庆宇，吕亚可，李静雯，张文昌

镉对雌性性腺的毒性是目前研究的热点之一，子宫和卵巢是其靶器官，且镉能通过胎盘，影响子代雌孕激素的合成与分泌[1]。课题组先前的研究发现，孕期镉暴露致子代成年雌性大鼠孕酮含量下降[2]。而microRNA(miRNA)可参与调控卵巢颗粒细胞雌孕激素的合成与分泌[3]。本课题拟建立孕期镉暴露动物模型，筛选子代中可能参与调控卵巢颗粒细胞雌孕激素合成与分泌相关miRNAs，并进行生物信息学分析，探讨镉致子代雌孕激素合成障碍的可能机制，为进一步研究子代卵巢损害的表观遗传机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 氯化镉(纯度：99%，美国Sigma公司)；SPF级SD大鼠[上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002]。

1.2 卵巢颗粒细胞提取 无菌条件下，迅速从大鼠背部取出双侧卵巢，置于经37 ℃孵育、含双抗(青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L)的DMEM-F12培养液中清洗，洗净后换置新的预热DMEM-F12培养液。体式显微镜下用25号针头刺破卵泡，引导颗粒细胞流出。收集所有细胞液，用0.075 mm(200目)不锈钢过滤网过滤，1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入PBS重悬细胞，按1∶1的比例将悬液加入已配好的50% Percoll分离液上，400×g离心20 min，吸取中间白色颗粒细胞层，加入PBS，1 000 r/min条件下离心5 min，洗涤2次，加入适量含双抗的DMEM-F12+10%FBS培养基制成单细胞悬液，血球计数板计数，调整细胞浓度为1×106个/mL，移至培养皿中，置于37 ℃培养箱中培养24 h，提取颗粒细胞总RNA。

1.3 获取卵巢颗粒细胞miRNA芯片数据 大鼠孕期分别予生理盐水、8 mg/kg氯化镉灌胃染毒，自然分娩获F1代；常规饲养至成年，与新购健康雄性大鼠交配产F2代。……